短时高压二氧化碳对双孢蘑菇褐变和活性氧代谢的影响

2016-09-10李顺峰田广瑞王安建刘丽娜魏书信

食品工业科技 2016年14期

关键词：双孢褐变抗坏血酸

李　静,李顺峰,田广瑞,王安建,刘丽娜,魏书信

(河南省农业科学院农副产品加工研究中心,河南郑州 450002)

短时高压二氧化碳对双孢蘑菇褐变和活性氧代谢的影响

李静,李顺峰,田广瑞,王安建,刘丽娜,魏书信

(河南省农业科学院农副产品加工研究中心,河南郑州 450002)

双孢蘑菇,短时高压二氧化碳处理,褐变,活性氧

高压二氧化碳在低温条件下能有效杀菌和钝化酶的活性[9-10],从而抑制果蔬及其产品的品质劣变,目前已有高压二氧化碳处理应用到果汁、鲜切果蔬褐变控制和保鲜的相关报道[9-14]。前期研究发现短时高压二氧化碳处理能较好的保持双孢蘑菇贮藏品质,但是该处理对双孢蘑菇脂质过氧化和活性氧代谢的影响还不清楚。本研究旨在确定短时高压二氧化碳对双孢蘑菇褐变、细胞膜透性、丙二醛(MDA)、抗氧化物质、活性氧积累、活性氧清除系统酶活性的影响,进一步探讨该处理对双孢蘑菇的作用机理,为短时高压二氧化碳在双孢蘑菇保鲜中的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

双孢蘑菇购自洛阳奥达特食用菌技术开发有限公司,采收后分层放入贮运保鲜箱预冷后立即运回实验室进行处理,选取大小、成熟度一致、颜色洁白、无开伞、无病虫害和机械损伤的蘑菇进行实验;硫代巴比妥酸、三氯乙酸、氢氧化钠、没食子酸、2,6-二氯靛酚、抗坏血酸、偏磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α-萘胺、过氧化氢(H2O2)、福林酚、牛血清蛋白分析纯;H2O2、SOD测试盒南京建成生物工程研究所。

FA2004C分析天平上海越平科学仪器有限公司;SHZ-B水浴恒温振荡器上海博远实业有限公司医疗设备厂;H2050R高速冷冻离心机湘仪离心机仪器有限公司;UV1800紫外分光光度计日本岛津公司;FE30电导率仪梅特勒-托利多(上海)有限公司;Color Flex EZ色差仪美国Hunterlab公司;TMS-Pro质构仪美国Food Technology Corporation(FTC)公司;本实验室定制的高压二氧化碳装置。

1.2实验方法

实验室环境检测领域包括行业独立的环境检测公司（或监测站）和相近行业的监测站，全国与本项目有关的检测公司（或监测站）有7 430余家[1]．检测行业的需求源于“认知”，是社会发展催生的新兴服务业．2014年，国家提出在环境保护领域开展第三方监测后，全国各地检测、监测公司迅速发展，之后的2年内全国成立了约1 500家第三方检测公司．

1.2.2褐变度测定Hunterlab ColorFlex EZ色差仪用标准白板(L*=94.11;a*=-1.08;b*=2.13)校正,测定双孢蘑菇盖的CIE-Lab表色系中L*值(从0～100变化,0是黑色,100是白色)，表示样品褐变度,L*值越大,表示样品颜色越白。每个处理测定12个整菇,结果取平均值。

1.2.3细胞膜透性测定采用相对电导率评价双孢蘑菇的细胞膜透性,相对电导率的测定参照Liu等[15]的方法。用打孔器将双孢蘑菇切成直径为15 mm、厚度为2 mm的圆片,称取1.0 g切好的圆片放入一定体积去离子水中浸泡1 h(25±1 ℃),用电导率仪测定活组织提取液的电导率,然后将含有样品组织的浸泡液煮沸30 min并用去离子水补足体积后,测定总电导率。活组织电导率占总电导率的百分比即相对电导率。

1.2.4脂质过氧化测定采用MDA含量评价双孢蘑菇脂质过氧化程度,MDA含量的测定参照Liu和Wang[8]的方法并略作修改。准确称取1.0 g双孢蘑菇样品加7.0 mL三氯乙酸,冰浴条件下研磨匀浆,12000×g离心20 min(4 ℃),取1.0 mL上清液与5.0 mL 0.67%硫代巴比妥酸(用0.05 mol·L-1NaOH溶解)混合后在100 ℃加热20 min,快速冷却后在12000×g离心10 min,分别测定上清液在450、532、600 nm处的吸光值。MDA的计算公式如下:

MDA含量(μmol·g-1)=[6.45(OD532-OD600)-0.56OD450]×提取液总体积/样品质量×1000

1.2.5总酚含量测定参照Gonçalves等[16]的方法,修改如下:取双孢蘑菇冻干粉1.0 g,加入60%甲醇7 mL,在40 ℃下振荡(100 r/min)提取2 h,15000×g离心10 min。取0.1 mL上清液加入稀释至1/10的福林酚试剂4.9 mL,反应8 min后,加入质量分数为20%的Na2CO31.5 mL,在760 nm处测量吸光值,每组样品做3次平行求平均值,以吸光度为纵坐标、以质量分数为横坐标,根据标准曲线(y1=0.0171x1-0.0057,R2=0.9977,y1为吸光值、x1为没食子酸质量分数,单位为mg·mL-1)计算样品中总酚的质量分数,样品中总酚的质量分数用没食子酸当量(mg·g-1)表示。

1.2.6抗坏血酸含量测定参照Vaz等[17]的方法,修改如下:取双孢蘑菇冻干粉1.0 g,加入质量分数为1%的偏磷酸7 mL,室温下提取45 min,然后在10000×g下离心5 min。取1 mL的上清液和9 mL浓度为0.5 mg/mL的2,6-二氯靛酚反应30 min再在515 nm处测量吸光值,每组样品做3次平行求平均值，根据标准曲线(y2=-4.556x2+0.7488,R2=0.9999,其中y2为吸光值、x2为抗坏血酸质量分数,单位为mg·mL-1)计算样品中抗坏血酸质量分数,结果以mg·g-1表示。

超氧阴离子产生速率(nmol·min-1·g-1)=(OD530+0.004)×提取液总体积×1000/0.005×吸取样品液体积×反应时间×样品质量

1.2.8H2O2含量测定采用H2O2测试盒测定。

1.2.9抗氧化酶活性测定准确称取1.0 g双孢蘑菇样品加5.0 mL 0.1 mol·L-1pH7.4的磷酸缓冲液(含0.8 g·L-1PVP和1 mmol·L-1EDTA),冰浴条件下研磨匀浆,12000×g离心20 min(4 ℃),上清液即为粗酶液。

SOD活性测定:采用SOD测试盒测定。

CAT活性测定:参照Liu等[15]的方法并略作修改。取2.4 mL 50 mmol·L-1pH7.0磷酸钠缓冲液加0.1 mL酶提液于25 ℃水浴预热2～3 min,再加入0.5 mL 40 mmol·L-1H2O2,摇匀,立即计时,H2O2的降解表示为240 nm处吸光度的下降。每30 s记录1次,记录5 min。以1 min内OD240降低0.01为一个酶活力单位(U),CAT活性表示为U·mg-1蛋白。

蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色法。

1.2.10数据处理采用SPSS 17.0和SigmaPlot12.5软件对数据进行分析处理,所有实验均重复3次。

2　结果与讨论

2.1短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇褐变度的影响

颜色是消费者判断双孢蘑菇是否可接受的重要参数,采后贮藏期间菌盖的褐变现象十分普遍,是导致商品价值下降的重要原因。从图1可以看出,双孢蘑菇的L*值随着贮藏时间的延长逐渐下降,对照的L*值下降速度较快,贮藏8 d后L*值从87.34降到77.61;0.3 MPa二氧化碳短时处理的双孢蘑菇在贮藏前期L*值下降明显,2 d后波动不大,且0～4 d的L*值均低于对照,仅8 d后的L*值高于对照,其中0.3 MPa二氧化碳短时处理的双孢蘑菇贮藏8 d后的L*值比对照组高3.96%,存在显著差异(p<0.05)。从短期护色效果来看,短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇的护色效果并不理想,这可能与短时高压二氧化碳处理破坏了双孢蘑菇的细胞结构有关。研究表明微生物的侵染能够活化双孢蘑菇多酚氧化酶,进而加速酶促褐变的发生[19],而高压二氧化碳处理能够抑制微生物生长[10],这可能是处理组双孢蘑菇在贮藏后期的颜色好于对照的原因之一。

图1　短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇色泽的影响Fig.1　Effect of short-time HPCD treatment on color of button mushroom during storage

2.2短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇细胞膜透性和脂质过氧化的影响

相对电导率和MDA含量是衡量细胞膜透性和稳定性的两个主要指标。通常认为相对电导率可以间接反映细胞膜的损伤程度,而MDA作为脂质过氧化主要产物,其含量的多少可间接反映细胞脂质过氧化的程度。短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇相对电导率和MDA含量的影响分别如图2和图3所示。从图2中可以看出,随着贮藏时间的延长,对照组双孢蘑菇的相对电导率从22.86%逐渐增大到28.33%;0.3 MPa二氧化碳短时处理组的双孢蘑菇相对电导率在贮藏期间则变化平稳,且贮藏0～6 d均高于对照,这可能与高压对细胞的破坏作用有关,而8 d后的相对电导率为26.43,比对照低6.71%。如图3所示,在8 d贮藏期内,对照组双孢蘑菇的MDA从最初的0.43 nmol·g-1增长到2.45 nmol·g-1,而0.3 MPa二氧化碳短时处理组的MDA含量则从1.01 nmol·g-1增长到2.01 nmol·g-1。贮藏前期处理组相对电导率和MDA含量均高于对照组,说明高压处理对细胞结构造成了伤害,加速了膜脂过氧化进程,而在贮藏后期处理组的相对电导率和MDA含量低于对照组,这可能与高压二氧化碳处理抑制了双孢蘑菇表面微生物数量的增长有关[10,20]。

图2　短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇相对电导率的影响Fig.2　Effect of short-time HPCD treatment on relative leakage rate of button mushroom during storage

图3　短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇MDA含量的影响Fig.3　Effect of short-time HPCD treatment on MDA content of button mushroom during storage

2.3短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇总酚和抗坏血酸含量的影响

多酚是双孢蘑菇体内主要的抗氧化物质,该类物质具有维护健康、预防癌症和心血管疾病的有益作用。抗坏血酸是双孢蘑菇体内重要的营养成分之一,然而该物质不稳定,易被氧化,是双孢蘑菇褐变的原因之一。本研究表明双孢蘑菇体内的总酚和抗坏血酸含量在整个贮藏期呈下降趋势(图4和图5)。由图4可知,贮藏初期(2 d)0.3 MPa二氧化碳短时处理组的总酚含量低于对照的含量,随着贮藏时间的延长,0.3 MPa高压二氧化碳短时处理组的总酚含量逐渐高于对照的含量,尤其是贮藏8 d时0.3 MPa二氧化碳短时处理组总酚含量比对照高。如前所述,在贮藏前期,0.3 MPa二氧化碳短时处理对双孢蘑菇的褐变抑制效果并不明显,而贮藏后期该处理对褐变的抑制效果则逐渐显现,这表明低褐变程度与高总酚含量有关,总酚含量是双孢蘑菇褐变的限制因素[21-22]。由图5可知,0.3 MPa二氧化碳处理组可显著降低抗坏血酸含量的损失,贮藏8 d后抗坏血酸含量分别为0.28 mg·g-1FW,比对照组的高18.12%,这说明0.3 MPa二氧化碳处理可以较好的保持双孢蘑菇体内的抗坏血酸含量。

图4　短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇总酚含量的影响Fig.4　Effect of short-time HPCD treatment on total phenolics content of button mushroom during storage

图5　短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇抗坏血酸含量的影响Fig.5　Effect of short-time HPCD treatment on ascorbic acid content of button mushroom during storage

2.4短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇活性氧的影响

图6　短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇·产生速率的影响Fig.6　Effect of short-time HPCD treatment on superoxide production rate of button mushroom during storage

图7　短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇H2O2含量的影响Fig.7　Effect of short-time HPCD treatment on H2O2 content of button mushroom during storage

2.5短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇抗氧化酶活性的影响

图8　短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇CAT活性变化的影响Fig.8　Effect of short-time HPCD treatment on CAT activity change of button mushroom during storage

图9　短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇SOD活性变化的影响Fig.9　Effect of short-time HPCD treatment on SOD activity change of button mushroom during storage

3　结论

此外,双孢蘑菇体内的总酚和抗坏血酸含量在整个贮藏期呈下降趋势,但是0.3 MPa二氧化碳短时处理能够减少双孢蘑菇体内总酚和抗坏血酸的损失,进而抑制双孢蘑菇的褐变。

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Effect of treatment with short-time high-pressure carbon dioxide on browning and activate oxygen metabolism ofAgaricusbisporus

LI Jing,LI Shun-feng,TIAN Guang-rui,WANG An-jian,LIU Li-na,WEI Shu-xin

(Institute of Agro-products Processing,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)