肠膜明串珠菌胞外多糖合成的蛋白组学分析

鄢明辉,吴正钧

(1.乳业生物技术国家重点实验室,光明乳业研究院,上海 200436;2.上海乳业生物工程技术研究中心,上海 200436)



肠膜明串珠菌胞外多糖合成的蛋白组学分析

鄢明辉1,吴正钧2,*

(1.乳业生物技术国家重点实验室,光明乳业研究院,上海 200436;2.上海乳业生物工程技术研究中心,上海 200436)

以高产胞外多糖的肠膜明串珠菌BD3749为材料,通过双向电泳技术分析了产糖过程中的蛋白质组。结果表明,在产糖过程中有131个蛋白发生了明显变化(2倍以上),其中25个蛋白有显著改变(10倍以上)。初步的质谱鉴定表明,其中包含GH70家族的糖基转移酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶以及分子伴侣。肠膜明串珠菌胞外多糖的合成是一个复杂的过程,涉及众多基因在蛋白水平的变化。

肠膜明串珠菌,胞外多糖,蛋白组,双向电泳

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是能够发酵碳水化合物并产生大量乳酸的革兰氏阳性、非芽孢菌的总称,在食品中具有悠久的应用历史,被广泛应用于发酵制品、肉类制品及医药保健品等领域。肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)是一种重要的工业用生产菌种,能够利用蔗糖产生不同聚合度的右旋糖苷(Dextran),右旋糖苷可用作血浆代用品,用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等症状的治疗。此外,明串珠菌还可产生的其他种类胞外多糖(EPS),如左旋糖苷(Levan)类型的果聚糖等,也被证实有重要的应用价值。虽然明串珠菌的胞外多糖在工业上得到广泛应用,但其合成机制仍不十分清楚。随着右旋糖苷及其他胞外多糖的广泛应用,阐明明串珠菌中负责EPS合成的关键酶及调控机理,对于高效制备所需求类型的胞外多糖可以提供技术上的支持。目前已经在明串珠菌中鉴定的葡聚糖蔗糖酶(GS)包括右旋糖苷合成酶(Dextransucrase)和果聚糖合成酶(Levansucrase)等,并且有多个GS基因得到克隆并实现了原核表达,如dsrA,dsrB,dsrD,dsrS等[1-4]。但对于这些基因在明串珠菌细胞内的功能(invivofunction),以及在多糖合成过程中如何协同作用尚不清楚。

蛋白质组(proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出,指由一个基因组(Genome)所表达的全套蛋白质(protein)。双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是蛋白质组学研究的核心技术,由O’Farrell等首次提出[5]。利用双向电泳技术构建蛋白质表达图谱,可以分离得到数以百计的蛋白质。乳酸菌中的蛋白质组学研究起步较晚,有研究者利用双向电泳技术对乳杆菌及双歧杆菌在酸性胁迫下的蛋白质组进行了研究[6-8]。国内张和平等利用蛋白双向电泳技术对多株乳杆菌在胁迫条件下的蛋白质组进行了分析[9-10]。

肠膜明串珠菌BD3749(CGMCC10064)是一株从泡菜中分离获得、能够利用蔗糖合成大量胞外多糖的菌株,其产生的胞外多糖由不溶性的多糖以及水溶性的多糖组成。因其在胞外多糖产量及类型上的优势,是研究乳酸菌胞外多糖合成的理想材料。鉴于上述分子克隆及原核表达在研究基因功能方面的局限性,本研究采用双向电泳来分析肠膜明串珠菌产糖条件下的蛋白质组,寻找负责胞外多糖合成的糖基转移酶,并通过优化培养及抽提条件,克服BD3749培养过程中产生的胞外多糖(水溶性及不溶性多糖)对总蛋白抽提及分析的影响。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

肠膜明串珠菌BD3749由乳业生物技术国家重点实验室提供;MRS 培养基(1 L)蛋白胨10 g,牛肉膏 5 g,酵母膏粉10 g,葡萄糖20 g,吐温-80 1 g,K2HPO42 g,乙酸钠 5 g,柠檬酸三铵 2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·4H2O 0.05 g;改良产糖培养基(1 L)蔗糖 20 g,蛋白胨 10 g,酵母提取物 5 g,K2HPO45 g;丙烯酸胺、Tris、SDS、TEMED、N,N＇-甲叉双丙烯酞胺、硝酸银、三氯乙酸上海生工生物;尿素、硫脲、DTT、CHAPS、碘乙酰胺、考马斯亮蓝、IPG(Immobilized pH gradient)干胶条(18 cm、pI 4～7)美国Bio-rad公司;正丁醇、过硫酸胺、无水乙酸钠、丙酮、EDTA、Na2S2O3、Na2CO3等;蛋白裂解液PL039及蛋白质定量试剂盒SK3031上海生工。

SDS-PAGE电泳仪Bio-rad公司;等电聚焦仪、Ettan DALT Twelve system 装置、Image Scanner 扫描仪及 Image Master 5. 0 图像分析系统美国GE公司;TGL-168 低温离心机德国 Eppendorf 公司。

1.2实验方法

1.2.1用于蛋白分析的培养条件的改良参考Jun等人的工作[11],对用于蛋白质分析的培养条件做了改良。使用20 g/L蔗糖、不加Ca2+的培养条件,产糖量显著降低,以便于后续的蛋白电泳分析。

1.2.2BD3749生长曲线测定及生长情况比较挑取MRS平板上活化的BD3749单菌落,转接至新鲜MRS液体中培养12 h后按1∶50转接至改良产糖培养基中(对照组以相同浓度的葡萄糖替代蔗糖),30 ℃摇床培养。期间每隔2 h取样测定OD600,每组取三个重复。同时取样经梯度稀释后涂布于MRS平板,置于厌氧箱中培养48 h后进行菌落计数。通过所得的活菌数量绘制生长曲线,比较添加葡萄糖和蔗糖条件下BD3749的生长情况。

1.2.3样品蛋白提取MRS液体中培养12 h的种子,以1∶50转接至50 mL改良产糖培养基中,30 ℃摇床培养12 h后离心收集到菌体,所得样品以0.5 mol/L NaOH洗三遍去除不溶性多糖,所得菌体沉淀中加入1 mL蛋白裂解液,100 W超声破碎,超声2 s间歇5 s,共3 min,超声结束后4 ℃,12000 r/min离心30 min,获得上清液,加入1 mL预冷丙酮,-20 ℃过夜。4 ℃,12000 r/min离心30 min,去除上清,待沉淀挥干丙酮后加入500 μL蛋白裂解液。使用 Bradford 法蛋白质浓度测定试剂盒对所得蛋白提取液进行浓度测定,具体步骤参照使用说明书。

1.2.4双向电泳

1.2.4.1等电点聚焦(IEF)取1.2.2中所得总蛋白样品150 μg,选用pH4～7 NL IPG预制干胶条,进行第一向等电聚焦,电泳参数见表1。

表1　等电聚焦电泳参数Table 1　Isoelectric focusing(IEF)parameters

1.2.4.2胶条平衡将聚焦完成的胶条加2D Equilibration Buffer(加1% DTT)10 mL,摇床平衡15 min。清洗胶条,加入2D Equilibration Buffer(加2.5% IAA),摇床平衡15 min。

1.2.4.3SDS-PAGE将平衡后的胶条放入凝胶板中,加入低熔点琼脂糖封胶液(0.5%低熔点琼脂糖+电泳缓冲液),室温静置20 min后开始第二向电泳。第二向SDS-PAGE凝胶浓度为12.5%,电泳参数设定为:100 V/胶,电泳45 min;200 V/胶,至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm处停止;冷循环设定温度为15 ℃。电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶进行染色。

1.2.4.4凝胶染色凝胶采用银染试剂盒进行染色,具体操作如下:水洗5～10 min,固定30 min,10%乙醇洗两遍,每遍5 min,水洗两遍,每遍5 min,敏化1 min,水洗两遍,每次1 min,银染20 min,水洗凝胶两次,每次30 s,显影5 min后拍照分析。

1.2.4.5凝胶图像扫描对脱色结束的聚丙烯酰胺凝胶进行扫描,分辨率为300 dpi。使用PDquest 8.0软件对图像进行分析。

2　结果与分析

2.1用于蛋白分析的培养条件改良

BD3749是一株高产胞外多糖的肠膜明串珠菌,在含200 g/L蔗糖的产糖培养基中产生大量胞外多糖,使得菌体分离和蛋白提取非常困难。在Jun等人的研究基础上[11],对产糖过程进行了优化,目的是在不明显影响糖基转移酶诱导效果的前提下,降低胞外多糖的产量。粗多糖测定表明,采用改良后的培养条件(含20 g/L蔗糖),BD3749总多糖的产量降低到5 g/L以下。

作为双向电泳的预实验,同时检测上述条件优化对于总蛋白分析的改善效果,对上述条件下的培养物进行了菌体总蛋白SDS-PAGE分析,如图1所示。结果表明,优化后的条件下,胞外多糖对于蛋白质分析的影响已经基本去除,SDS-PAGE分析能够得出清晰的蛋白条带。

图1　优化后的条件下BD3749菌体总蛋白SDS-PAGE结果Fig.1　SDS-PAGE of total protein of BD3749 cultivated under the optimized condition 注:S1,S2为BD3749在两种不同产糖条件(振荡培养和静置) 下的总蛋白样品,右侧为蛋白分子量标尺。

2.2不同条件下BD3749的生长情况比较

在上述实验结果的基础上,选择20 g/L蔗糖条件来分析产糖过程中的蛋白表达差异。因为BD3749的胞外多糖合成主要是以蔗糖作为底物,同样条件的葡萄糖培养物基本不合成胞外多糖,因此,以20 g/L的葡萄糖作为对照组。

为了避免不同培养条件菌体生长差异对蛋白分析的干扰,对BD3749分别在20 g/L葡萄糖和20 g/L蔗糖培养基中的生长情况进行了比较,如图2所示。OD600值测定表明,BD3749在蔗糖培养基中能够更快地积累生物量,这很大程度上是由于合成的胞外多糖。而菌体总蛋白浓度的结果表明,葡萄糖和蔗糖培养物中菌体生长速度相当(葡萄糖和蔗糖条件下同体积培养物所得的蛋白浓度相差不大)。

图2　BD3749在葡萄糖和蔗糖培养基中的生长情况Fig.2　Growth of BD3749 in medium containing glucose(Glc)or sucrose(Suc)

2.3产糖条件下蛋白组的双向电泳分析

分别取BD3749在上述优化条件下的对数期培养物50 mL进行菌体总蛋白抽提,所得总蛋白经Bradford法定量后进行双向电泳,经银染后所得结果如图3所示。

图3　BD3749产糖条件下的双向电泳分析Fig.3　2-D gel electrophoresis of BD3749 total protein

双向凝胶电泳结果表明,葡萄糖和蔗糖培养条件下的菌体总蛋白的蛋白点吻合率在90%以上。PDquest 8.0 软件分析表明,蔗糖和葡萄糖两种条件下有明显差异(差异在2倍以上)的蛋白点为131个,其中差异倍数在10倍以上的蛋白点为25个。

2.4差异表达的蛋白分析

在上述差异表达的蛋白点中,重点关注是BD3749的糖基转移酶。已有的研究表明,肠膜明串珠菌中负责胞外多糖合成的主要是葡聚糖蔗糖转移酶(Glucansucrase,属于GH70家族),而已发现的GH70家族的糖基转移酶分子量都很大,在180 ku以上[3,12]。同时,如图3所示,双向电泳结果表明,产糖过程中明显上调的蛋白点主要分布于较高分子量、中性蛋白区域(图3中右上角部分)。因此,对大分子量的差异蛋白(图3中右上角方框中部分)进行了重点分析。通过对上述蛋白斑点(5个高分子量的斑点)进行质谱分析(代表性肽谱图如图4所示),除了GH70家族的糖基转移酶以外,鉴定除了包含柠檬酸合成酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和分子伴侣在内的一系列差异表达的蛋白质,如表2所示。

图4　代表性肽指纹图谱Fig.4　Representative peptide fingerprinting map 注:A图中谱图对应的肽段N-SLVEGESVEVGPTFGLR-C, 匹配到的蛋白为gi|517441595,B图中谱图对应的肽段 N-AYYLPGVDSSKITAK-C,匹配到的蛋白为gi|499999644。

胞外多糖的合成及调控是一个复杂的生物学过程,其中可能涉及到对环境中的信号(如诱导物蔗糖)的感知及信号转导、多糖合成相关的基因表达调控以及糖基转移酶加工及分泌等环节。蛋白组分析结果表明,双组份信号系统相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶KFRI-MG_1289在产糖过程中显著上调,同

表2　差异蛋白的质谱鉴定结果Table 2　MASS analysis of differentially expressed proteins

时,GH70家族的糖基转移酶AHF19404.1也发生显著上调。同时,分子伴侣GroEL也显著上调,提示其可能在多糖合成相关酶的加工及分泌中发挥功能。此外,柠檬酸合酶的表达量也发生变化,这可能与不同碳源导致的细胞内代谢差异有关。

此外,除了上述已经成功鉴定的蛋白,差异蛋白中可能还包括了对这些糖基转移酶的表达进行调控的转录因子,对这些转录因子的鉴定有望进一步解释胞外多糖合成的调控机制。因此,更多的差异蛋白点的鉴定工作还在进行中。

3　结论与展望

对肠膜明串珠菌BD3749产糖过程的总蛋白进行了双向电泳分析,从中找到大量在产糖过程中发生显著改变的蛋白点,通过质谱分析对其中的5个大分子量差异蛋白进行了鉴定,其中包括GH70家族的糖基转移酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶以及分子伴侣。

本研究以高产胞外多糖的肠膜明串珠菌BD3749作为材料,通过双向电泳技术分析了其产糖过程的蛋白质组,得到了产糖过程中显著改变的25个蛋白斑点,并已成功地对其中的5个高分子量的斑点进行了鉴定。为了进一步阐述产糖过程的调控机制,正在对其他的差异斑点进行鉴定,这些结果将进一步揭示糖基转移酶基因的转录调控机理,从而对产糖相关的基因表达调控有更全面的认识,为通过基因工程手段改良肠膜明串珠菌产糖特性提供理论支撑。

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Proteomic analysis of EPS synthesis ofLeuconostocmesenteroides

YAN Ming-hui1,WU Zheng-jun2,*

(1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Bright Dairy Research Institute,Shanghai 200436,China;2.Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology,Shanghai 200436,China)

The proteome ofLeuconostocmesenteroidesBD3749,a strain with large amount of exopolysaccharides(EPS),was analyzed with 2-D gel electrophoresis. The results showed that during the process of EPS production,131 proteins were obviously changed by 2 folds,among which 25 proteins were dramatically changed by 10 folds. MASS analysis of the differential protein dots showed that glycosyltransferases of GH70 family,as well as chaperones were up-regulated in the process of EPS production. These results indicated that EPS synthesis was a complicated process which involved the regulation of many genes.

Leuconostocmesenteroides;exopolysaccharides(EPS);proteomics;2-D gel electrophoresis

2015-12-29

鄢明辉(1985-)，男，博士，研究方向：乳酸菌，E-mail:yanminghui@brightdairy.com。

吴正钧(1966-)，男，高级工程师，研究方向：乳业生物技术，E-mail:wuzhengjun@brightdairy.com。

“十二五”国家科技支撑计划课题(2013BAD18B01)。

TS252.54

A

1002-0306(2016)14-0158-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.023