8种纳豆挥发性香气成分的比较研究

刘　野,苏　杭,宋焕禄,苏柯冉,王　鑫

(北京工商大学食品学院,北京市食品添加剂工程技术研究中心,食品质量与安全北京实验室,北京 100048)



8种纳豆挥发性香气成分的比较研究

刘野,苏杭,宋焕禄,苏柯冉,王鑫

(北京工商大学食品学院,北京市食品添加剂工程技术研究中心,食品质量与安全北京实验室,北京 100048)

为比较不同种类纳豆挥发性香气成分的差异,本研究通过采用SPME结合GC-O-MS、感官评价分析和电子鼻技术对自制纳豆与5种日本纳豆和2种国产纳豆的气味进行分析。结果显示,自制纳豆与其他品牌的纳豆相比,在香气成分的种类上差别不大,但在整体化合物含量上与日本纳豆还有一定的差距,特别是具有较强呈味能力的酮类和吡嗪类物质,而自制纳豆中这两类化合物含量均高于国产纳豆。通过电子鼻分析，自制纳豆与北海道纳豆、燕京纳豆香气成分和整体呈现的香韵较为类似。

纳豆,挥发性香气化合物,GC-O-MS,感官评价,电子鼻

纳豆(Natto)是一种由蒸煮好的大豆经纳豆芽孢杆菌(BacilluSubtilisNatto)发酵而制成的保健食品,作为一种传统大豆发酵食品,可追溯上千年历史之久。纳豆色泽棕黄,表面附着一层粘性物质,挑起时会呈现拉丝的状态,因其独特的风味和功能在日本广受欢迎[1]。纳豆具有独特的风味和粘性,并富含多种营养成分:蛋白质、氨基酸、纤维素、维生素等,因其含有纳豆激酶、γ-多聚谷氨酸[2]、纳豆异黄酮、超氧化物歧化酶[3]、大豆磷脂、皂苷[4]、卵磷脂、亚油酸、亚麻酸、果糖、生育酚等多种生理活性物质,能增强体质,提升机体免疫力。

目前,关于纳豆的研究主要集中于纳豆芽孢杆菌的菌种的分离筛选,及纳豆功能活性的研究,而对于其风味的研究则很少。仅有的几篇关于纳豆风味的文献也主要着眼于纳豆风味改良方面的研究。关茵等对料液比、蒸煮时间、蒸煮温度、发酵时间和接种量等工艺参数进行调整以减少纳豆的氨味[5]。陈文珊等研究认为3%味精,姜汁:茶叶比例为10∶1时,产品香气和滋味最为协调[6]。谢元等则从工艺参数和辅料添加两方面入手对纳豆风味进行改良[7]。上述研究均缺少对纳豆挥发性香气成分的分析和比较。由于不同品牌纳豆生产工艺存在一定差异，因此产品风味也有较大区别。纳豆风味是其重要品质指标，会影响到人们对于纳豆的消费和食用。因此本研究通过对自制的纳豆与市售7种纳豆进行了SPME提取结合GC-O-MS定量分析,并对自制纳豆与市售纳豆、日本纳豆与国产纳豆挥发性香气成分进行比较分析,并通过电子鼻技术结合PCA对几种纳豆气味进行相似度分析，一方面可以确定纳豆含有的挥发性香气成分的种类和含量范围，另一方面为纳豆生产企业工艺改良提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1原料

表1　实验用纳豆Table 1　Natto in this study

1.1.2试剂实验所用的主要试剂有系列烷烃C7～C30;标准化合物2,3-丁二酮、5-甲基-2-己酮、2-庚酮、3-羟基-2-丁酮、2-壬酮、1-辛烯-3-醇、糠醇、2-乙基丁酸、3-甲基丁酸、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、6-甲基-2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯甲醛、吡啶、2-戊基呋喃和内标物2-甲基-3-庚酮均购置于美国Sigma-Aldrich公司,色谱纯。

1.1.3仪器气相色谱仪7890A、三重四级杆质谱7000B美国Agilent公司；Sniffer 9000嗅味检测仪瑞士Brechbühler公司；极性DB-Wax毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)美国J&W公司；JA2003型数字电子天平上海天平仪器厂；HH-1型数显电子恒温水浴锅金坛市至翔科教仪器厂；固相微萃取针(DVB/CAR/PDMS纤维层)美国Supelco公司；PEN-3型电子鼻德国Airsense公司。

1.2实验方法

1.2.1自制纳豆的制备条件参考童军锋等方法[8]。该纳豆制备条件为通过以纳豆激酶活性为主要指标优化后条件。通过单因素实验确定了浸泡时间、蒸煮时间、接种量、发酵温度、发酵时间、后熟时间这6个工艺的最佳参数，分别为浸泡时间15 h、蒸煮时间45 min、接种量3 %、发酵温度38 ℃、发酵时间28 h、后熟时间1 d。而后通过响应曲面优化出纳豆激酶活性最高时的工艺参数为浸泡时间15 h、蒸煮时间51 min、发酵温度37.5 ℃。

1.2.2静态顶空-固相微萃取(SPME)称取5 g纳豆样品粉碎后置入40 mL顶空瓶中,加入1 μL浓度为已配制好的浓度为0.816 μg/μL的内标物2-甲基-3-庚酮溶液,密封;50 ℃水浴平衡20 min;将固相微萃取针头插入顶空瓶,推动针头使其处于顶空吸附状态,吸附40 min后进样,分流比5∶1。

1.2.3气相色谱-质谱联用仪(GC-O-MS)参数GC条件:进样口温度250 ℃,采用DB-Wax和DB-5 ms两种极性不同的色谱柱,柱温箱升温程序:初始温度40 ℃,保持3 min,然后以5 ℃/min升至200 ℃,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持3 min,后运行3 min。载气为高纯氦气,恒定流速1.2 mL/min,分流比5∶1。

质谱条件:电子轰击(electron impact,EI)离子源,离子源温度230 ℃,电子能量70eV,传输线温度280 ℃,四级杆温度150 ℃,溶剂延迟为4 min,质量扫描范围35～350 AMU,扫描时间200 ms,检测电压350 V。

嗅闻方法:嗅觉检测器接口温度为200 ℃,毛细管柱末端分离出的化合物以1∶1分流比分别进入MS与嗅闻检测仪。由3名专业嗅闻实验员在嗅闻检测仪前通过嗅闻记录香气化合物的保留时间,气味强度以及气味特征。

1.2.4化合物定性本实验中化合物的定性是由嗅闻、NIST谱库分析以及线性保留指数(RI值)3种方法结合共同来定性分析。

1.2.4.1嗅闻定性单一的未知化合物从GC-MS中分离出来,进入嗅闻口,3名嗅闻人员通过对化合物的嗅闻来记录化合物的保留时间和气味特征,并最终共同来确定其香气特征。

1.2.4.2质谱(MS)定性未知化合物信息通过Masshunter Workstation数据处理软件采集并处理,在NIST谱库2.0中进行检索,匹配度较高的几种作为可能的化合物。

1.2.4.3线性保留指数(RI值)定性以正构烷烃C6～C25的混合标品通过与样品相同的升温程序,并通过样品中各化合物的保留时间与各正构烷烃的保留时间计算出RI值,并与标准RI值进行比对,从而对化合物定性。RI值的计算公式:

注:ta为未知化合物a的保留时间,tN为正构烷烃CN的保留时间,样品的保留时间需落在正构烷烃CN和CN+1之间。

1.2.5化合物定量本实验采用模糊定量与相对校正因子来对化合物进行精确定量,相对校正因子由单点校正法得到。将质谱的扫描条件改为选择离子扫描(SIM)。相对校正因子计算如下:配制合适浓度的混标和内标,通过GC-MS/SCAN,确定每个化合物的出峰时间以及特征离子,然后再通过GC-MS/SIM,确定每个化合物精确的峰面积[9]。

每个化合物的相对较正因子的计算公式:

注:fi是被鉴定出的每个化合物的相对校正因子;mi和ms分别是化合物标品和内标的浓度;Ai和As分别是化合物标品和内标的峰面积。

1.2.6纳豆感官评定方法纳豆风味感官评定由经专业培训的7人完成,品评需在安静、无味的环境下进行。品评前一小时需禁止评定人员进食气味较大或影响品评感官的食物。品评期间独自完成。切换样品时,温水漱口,间隔5min。评分标准采用5分制,无法感受到记为0分,能强烈感受到为5分。称取各样品10g置于40mL顶空瓶中,嗅闻,评分。

1.2.7电子鼻技术样品测试方法电子鼻检测利用10种对不同化合物敏感程度不同的传感器阵列,详见表4。

表2　感官鉴评对应模型Table 2　Model applied in sensory evaluation

表4　不同种类纳豆间香气成分含量的分析Table 4　The volatile compound content of eight kinds of natto

续表

表3　电子鼻传感器信息Table 3　Sensor Information of electronic nose

取3 g纳豆样品置于40 mL顶空瓶内,密封待测。电子鼻采样时间为1s/组;传感器自清洗时间为300 s,在换不同样品时,清洗时间600 s;样品准备时间5 s;传感器归0时间10 s;进样流量300 mL/min;分析采样时间120 s。

1.2.8数据分析方法主成分分析(PCA)方法是将所提取的传感器多指标的信息进行转换和降维,并对降维后的特征向量进行线性分类,最后在PCA分析的散点图上显示主要得两维散点图。

2　结果与讨论

2.1气相-嗅闻-质联用(GC-O-MS)对不同纳豆香气成分分析

由表4所示,不同的品牌纳豆间的香气成分组成也各不相同。这是由于纳豆发酵过程中,原料、发酵菌种和生产工艺都会影响发酵的过程,进而改变香气成分的组成。在纳豆中,共有9大类别的化合物,由于醚类和醛类化合物检测出的含量极少,只有竹炭和完熟纳豆中检测到含量只有55.91、47.90 ng/g的二甲醚,而醛类物质只在竹炭纳豆和完熟纳豆中检测到,给香气体系中增添青香与水果香味。其他类物质中主要是呋喃类、恶唑类和麦芽酚,分别提供熟大豆味、烤香味和奶油味,因其在纳豆中含量较少,图中未显示。

化合物总体含量中,竹炭纳豆中酮类、酯类、醇类的含量均较高,提供更多的酸香、奶香和果香香韵。完熟纳豆的吡嗪类、酸类和芳香族类的含量居高,在8种纳豆中,完熟纳豆是唯一的碎纳豆,其加工工艺较为特殊,完熟纳豆是将之前豆粒切碎为1/6左右,所以在菌种发酵时可以利用大豆内的营养成分,接触面积也更大,所以发酵得更彻底,而吡嗪和酸类是发酵后期的产物,完熟纳豆中的酸为异丁酸和2-甲基己酸,与其他纳豆以2-乙基丁酸作为主要酸成分的构成也不同。

图1　不同种类纳豆间化合物含量比较分析图Fig.1　Comparative analysis of volatile compound content in eight kinds of natto

如图1所示,实验自制的工艺纳豆与其他品牌的纳豆相比,在香气成分的种类上差别不大,但在整体化合物含量上与日本纳豆还有一定的差距,风味贡献较大的酮类、吡嗪类物质与日本纳豆在含量上有不小的差距,但高于国产纳豆。不过自制的纳豆在某些化合物含量上例如2-丁酮、吡啶、6-甲基-2-庚酮、2-壬酮、2-乙基丁酸的含量均为最高,且有3种化合物(+)-柠檬烯、4-甲基嘧啶、和2,6-二甲基吡嗪只在自制纳豆中检测出,分别代表橙子香气、烤香与坚果味。

2.2不同种类纳豆感官评价结果

如图2所示,感官评价结果可以看出,在纳豆的风味轮廓中,坚果香、焦糖香、焙烤香、酸味、霉腐味是主要的风味构成,而甜味、奶香、果香的香韵相对较弱。自制纳豆的酸味和霉腐味是较为突出的,坚果香气和奶香味也相对较强,而焙烤香较弱。

图2　不同种类纳豆间气味轮廓比较分析图Fig.2　Comparative analysis of odor profile in eight kinds of natto

从仪器检测与感官鉴评结合来看,酸类化合物虽然在含量上不高,但在感官鉴评中酸味却很明显,在嗅闻中首先呈现的就是酸味,推测在不同气味混合的体系中,人对酸的感官较为敏感,且在香气复杂的情况下,酸味可以较好地辨别。一个比较反常的现象,在本场水户纳豆和御城纳豆中均没有检测出酸类物质,但两者却呈现出酸味,且前者比后者强很多,推测在纳豆中酸的香韵并不只有酸类提供,有酸味香韵的酮类,例如3-羟基-2-丁酮均会提供一定的酸感,但酮类的酸味较为柔和,而酸类物质较为尖刺。另外,从自制纳豆和昆布纳豆对比来看,酸类物质的增加会使霉腐味更加凸显,使整体呈现为一种酸臭味。而从本场水户纳豆与御城纳豆对比来看,御城纳豆中不含酸类,但仍呈现较强的霉腐味,这是由于没有适量酸味的掩盖,焙烤味很强烈的同时,腐败味、氨味愈加明显。而昆布纳豆中,酸的含量适宜,腐败感较弱,所以,较高或较低的酸含量均会促进腐败感的增强,而合适的酸含量则会抑制腐败感,呈现一种酿香、酱香。

在分析中还发现,呈现干酪似霉腐味的物质主要为2-乙基丁酸,通过御城纳豆中并不含酸类物质,只含有相对酸类含量高的吡嗪类成分,却氨味、腐败感依然很强的现象来看,腐败味的来源不只有酸类提供,含有两个N原子的吡嗪类物质才是人们所形容纳豆“氨味”的主要来源,几种含N的吡嗪物质富集会整体呈现腐霉味,这也是在感官上本不该出现的不良气味的主要来源。

2.3电子鼻对不同种类纳豆香气成分分析

如图3所示,电子鼻检测到的纳豆样品气味信号数据经过PCA分析,其中主成分1和主成分2的累积方差贡献率为99.62%,整体累积方差大于85%,说明通过PC1-PC2的二维判别图可以很好地代表样品的主要信息特征。以两个主成分的0坐标界为轴可以看出几种纳豆处于第一象限与第四象限,呈簇状聚集的样品说明其风味的差别较小,实验自制、北海道、燕京、本场水户四种纳豆呈簇状聚集,风味相似度较高,作为第一组群;御城纳豆与其他样品差别较大,只和完熟纳豆有略微的交集,作为第二组群;完熟纳豆与昆布纳豆有较大的交集,香气组成上有一定的相似度,作为第三组群;竹炭纳豆与其他样品均不同,作为第四组群。

图3　8种纳豆气味特征主成分分析(PCA)图Fig.3　Principal component analysis of odor characteristic in eight kinds of natto

由图3可知,电子鼻PCA分析与之前的结论较为相符,御城纳豆与竹炭纳豆与其他样品差别较大的原因是御城纳豆中不含酸类,且只在其中检测出2-乙基-6-甲基吡嗪。而竹炭纳豆的特征风味组分中,具有酸奶香、干酪香韵的3-羟基-2-丁酮含量很高,是其区别于其他纳豆的主要成因。

本论文自制纳豆与北海道纳豆、燕京纳豆有很大的交集,说明这三种样品的风味差别较小,也说明自制纳豆与北海道纳豆中香气成分和整体呈现的香韵较为类似。

3　结论

通过GC-O-MS对几种纳豆样品挥发性香气成分进行定量分析得出：竹炭纳豆中的酮类、酯类、醇类物质均最高，完熟纳豆中吡嗪类、酸类、芳香族类含量均最高。

通过感官鉴评得出如下结论：纳豆中酸类含量在整体风味中较低，感官上却异常明显，酸类物质含量对整体风味的感官上有较大影响，含量过高或过低均会使霉腐味加重；在呈酸味的化合物中，酮类物质也起到很大的作用；腐霉味的来源有两个途径，以2-乙基丁酸为主的酸类物质与2,5-二甲基吡嗪为主的吡嗪类物质。

通过电子鼻PCA分析得出：自制纳豆与北海道纳豆、燕京纳豆较为相似，御城纳豆、竹炭纳豆的风味与其他纳豆有较大的区别。

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Comparative study of volatile aroma compounds in eight kinds of natto

LIU Ye,SU Hang,SONG Huan-lu,SU Ke-ran,WANG Xin

(School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing 100048,China)

In order to compare the difference of volatile compound in different kinds of natto,self-make natto,5 kinds of natto from Japan,and 2 kinds of natto from China were analyzed by SPME-GC-O-MS,sensory evaluation,and electronic nose. Results showed that there was no difference between self-make and the other kinds of natto on compound type,but the whole compound content of self-make natto were less than that of natto from Japan,especially ketone and pyrazine,which were more than that of natto from China. By PCA,there was large intersection among self-make,Hokkaido,and Yanjing natto,suggesting that the three kinds of natto had similar middle note.

natto;volatile aroma compounds;GC-O-MS;sensory evaluation;electronic nose

2015-06-15

刘野(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：食品风味化学，E-mail:liuyecau@126.com。

北京市属高等学校创新团队建设与教师职业发展计划项目(IDHT20130506)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)05-0302-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.052