棘胸蛙白内障病原鉴定及药敏试验

2016-09-09程晓云郑芊芷宋婷婷郑善坚郑荣泉浙江师范大学特种水产研究所浙江金华2004遂昌县森林资源管理总站浙江丽水200浙江师范大学附属中学浙江金华2004

浙江农业科学 2016年7期

程晓云，郑芊芷，宋婷婷，郑善坚*，郑荣泉（.浙江师范大学特种水产研究所，浙江金华 2004；2.遂昌县森林资源管理总站，浙江丽水 200；.浙江师范大学附属中学浙江金华 2004）

棘胸蛙白内障病原鉴定及药敏试验

程晓云1，2，郑芊芷3，宋婷婷1，郑善坚1*，郑荣泉1
（1.浙江师范大学特种水产研究所，浙江金华 321004；2.遂昌县森林资源管理总站，浙江丽水 323300；3.浙江师范大学附属中学浙江金华 321004）

从患病棘胸蛙（Quasipaa spinosa）中分离到BN1306菌株，经肌肉注射回健康棘胸蛙，复制出棘胸蛙白内障病的基本症状，并显示对棘胸蛙有较强的致病性。通过形态学、生理生化试验、16S rDNA测序等方法鉴定该致病菌为布氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）。药敏试验显示该菌对诺氟沙星、链霉素、四环素、吡哌酸高度敏感，对氟哌酸、头孢哌酮、庆大霉素、青霉素、新霉素、林可霉素、先锋霉素和红霉素不敏感。

棘胸蛙；布氏柠檬酸杆菌；白内障

文献著录格式：程晓云，郑芊芷，宋婷婷，等.棘胸蛙白内障病原鉴定及药敏试验［J］.浙江农业科学，2016，57（7）：1141-1143，1151.

棘胸蛙（Quasipaa spinosa）主要分布于我国长江以南地区，是一种兼具食用和药用价值的蛙类［1］。近年来，由于养殖规模扩大、养殖密度提高、不合理的饲养管理以及种质衰退等原因，棘胸蛙病害时有发生。苏雪红等［2］调查发现棘胸蛙的病害包括白内障、烂皮病、红腿病、胀肚病、出血病等10余种主要疾病，但相关病原的研究报道较少。王瑞君等［3］报道了棘胸蛙烂皮病病原奇异变形杆菌（Proteusmirabilis），宋婷婷等［4］报道了棘胸蛙体表发白、肝脏发黑囊肿的一种新型疾病的病原为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）。棘胸蛙白内障病症近年来呈现多发性态势，发病率高，危害大，亟需开展相关的病原研究。为了达到控制该病的目的，我们于2014—2015年进行了棘胸蛙白内障病的病原诊断鉴定及敏感药物筛选，以期为该病的防治和诊断提供依据。

1　材料与方法

1.1致病菌分离

患白内障棘胸蛙和健康棘胸蛙均取自浙江省丽水市遂昌县棘胸蛙养殖场，患白内障棘胸蛙体重为150～200 g每只，健康棘胸蛙平均体质量为（100± 20）g。发病棘胸蛙无菌操作分别取病蛙的眼睛、肝脏等病变部位，划线接种于普通营养琼脂平板，于28℃下培养24 h，挑取占优势的菌落重复划线分离，直至得到纯种，然后将纯化菌转接至斜面培养，保存备用。

1.2人工感染试验

1.2.1菌液制备

将纯培养细菌分别接种在普通营养液体培养基中，置于振荡频率为200 r·s-1的摇床中振荡培养18 h，用灭菌生理盐水采用比浊管法稀释，配置成5×108m L-1浓度的菌液，置4℃环境中贮存备用。

1.2.2人工感染

采用肌肉注射的方式感染健康棘胸蛙。将制备的菌液按每只0.2 mL剂量分别注射健康棘胸蛙，每组10只；设等量的生理盐水为对照，注射剂量为每只0.2 m L。放养在经消毒的水族箱中饲养观察，观察期为15 d。

1.3生理生化特性鉴定

对分离的致病菌进行革兰氏染色和生理生化试验，鉴定方法参照有关文献［5］所述方法进行。

1.416S rDNA鉴定

采用TaKaRa公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒提取菌株的基因组DNA，设计通用引物（正向引物5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，反向引物5＇-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3＇）进行PCR扩增，并将PCR扩增的细菌16S rDNA产物送至上海生工生物技术公司进行测序。

1.5药物敏感试验

药物敏感试验采用药敏纸片法。将分离致病菌株于28℃培养24 h，用无菌生理盐水稀释菌液至1×106m L-1，取200μL菌液涂布于营养琼脂平板上，稍干后取药敏纸片均匀贴片于培养基上，28℃培养18 h后测量抑菌圈大小。根据药敏纸片标准确定敏感性。

2　结果与分析

2.1病原菌的分离

从发病的棘胸蛙眼睛和肝脏部位分离到BN1306、BN1307细菌。

2.2致病菌感染

将分离的2株细菌经肌肉注射健康棘胸蛙。结果显示，BN1306菌株注射棘胸蛙体内，棘胸蛙一周内死亡率为80%，症状表现为蛙眼球晶体皮质浑浊，眼球凸出，眼睑灰白，与自然发病基本相同（图1）；BN1307菌株和对照组无感染发病现象，表明BN1306菌株为棘胸蛙白内障的致病病原，且对棘胸蛙有较强的致病性。其感染结果如表1所示。

图1　病变棘胸蛙眼球特征

表1　分离菌对棘胸蛙的人工感染结果

2.3病原鉴定

2.3.1致病菌形态及生理生化鉴定

BN1306菌为革兰氏阴性短杆菌，无鞭毛，无荚膜和芽孢，在普通营养琼脂培养基中观察，菌落光滑半透明，边缘整齐，中间略隆起，菌落可随时间的延长而增大。生理生化鉴定结果如表2所示。根据《常见细菌系统鉴定手册》鉴定，BN1306菌为布氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）。

表2　细菌生化鉴定结果

2.3.216S rDNA测序鉴定

对BN1306细菌利用16SrDNA通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送至上海生工生物技术公司进行测序。测得16S rDNA序列为1 401 bp（图2）。

通过NCBI网站，对BN1306菌的16S rDNA序列与GenBank数据库中各种菌的16S rDNA序列进行比对，与其相似性最高的前9个菌株见表3。通过16S rDNA序列同源性比较，发现BN1306菌株所得结果与GenBank上收录的布氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）同源性达到99%，因此可进一步确认引起该病的病原菌为布氏柠檬酸杆菌。

表3　菌株16S rDNA序列同GeneBank中细菌菌株同源性比较

2.4药敏情况

药敏试验结果如表4所示。布氏柠檬酸杆菌对诺氟沙星、链霉素、四环素、吡哌酸高度敏感，对氟哌酸、头孢哌酮、庆大霉素、青霉素、新霉素、林可霉素、先锋霉素和红霉素不敏感。

图2　细菌16S rDNA测序结果

表4　分离菌对抗菌药敏感性

3　讨论

布氏柠檬酸杆菌，也称布氏枸橼酸杆菌，是肠杆菌科柠檬酸杆菌属成员。作为条件致病菌，主要在人和动物体内分离到，可以引起动物黏膜发生炎症、溃疡［6］。布氏柠檬酸杆菌在水生动物方面也有引起中华鳖口咽腔溃烂综合症的报道［7］，但该菌引起棘胸蛙白内障则首次报道。

由于蛙类的白内障是以病症特征来命名，因此，关于蛙类的白内障是否是一个单独的疾病种类，还是其他疾病所表现出的症状，仍有一些争议，如牛蛙的脑膜炎脓毒性黄杆菌引起的歪头脑膜炎病也有白内障的症状［8］。目前在报道牛蛙白内障病的病原和症状上有些不同，陈晓凤等［9］认为是由醋酸钙不动杆菌（Acinetohacter calcoaceticus）引起的牛蛙白内障病，肝脏紫黑色有肿大或紫红色稍肿大，双腿肌肉呈黄绿色；纪荣兴等［10］报道认为，引起牛蛙白内障病原为嗜水气单胞菌，患病牛蛙肝脏颜色变淡、微肿大，双腿肌肉红色，伴有红腿症状等。因此，棘胸蛙的白内障疾病是否还有其他病原，以及布氏柠檬酸杆菌引起的病理过程仍需进一步研究。

药敏实验表明，诺氟沙星、链霉素、四环素、吡哌酸等抗菌药物对布氏柠檬酸杆菌有较好的抗菌作用，在实际防治过程中，在饲料中添加敏感药物20 mg·kg-1剂量的诺氟沙星和40 mg·kg-1保肝药物肝肾康拌食投喂，连用5 d，同时用0.5 mg· L-1二氧化氯对水体进行消毒，起到良好的治疗效果。由于棘胸蛙白内障的病因和病理复杂，发病严

重的病蛙已几乎不摄食，关键还是防重于治。养殖场应加强棘胸蛙饲养管理，加强疾病预防，严格保证水体的流动更新，加强水质的消毒工作，降温保洁，放养密度要适当，切勿放养过密。这对于预防该病的发生或者大面积蔓延具有切实有效的作用。

［1］ YE S，HUANG H，ZHENG R，et al.Phy1ogeographic analyses strong1y suggest cryptic speciation in the giant spiny frog（Dicrog1ossidae：Paa spinosa）and interspecies hybridization in Paa［J］.Plos One，2013，8（7）：e70403.

［2］苏雪红，张正江，纪任宗，等.棘胸蛙病害调查及药敏试验初报［J］.福建水产，2001，3（1）：32-37.

［3］王瑞君，熊筱娟.棘胸蛙烂皮病奇异变形杆菌的分离、鉴定及对药物敏感性研究［J］.淡水渔业，2012，42（4）：36-37.

［4］宋婷婷，郑荣泉，张俊美，等.一种棘胸蛙新类型疾病病原分析［J］.福建水产，2014，36（5）：344-350.

［5］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.

［6］周昱，陈琼，孔繁德，等.PCR快速检测布氏枸橼酸杆菌方法的建立与初步应用［J］.中国畜牧兽医文摘，2013，29（3）：42-48.

［7］李本旺，李春枝，张邦杰，等.中华鳖口咽腔溃烂综合症病原的研究［J］.水产科技情报，2000，27（5）：210-213.

［8］叶雪平，杨广智，罗毅志.牛蛙脑膜炎（歪脖子病）病原分离及防治技术研究［J］.浙江水产学报，1996，15（4）：301-304.

［9］陈晓凤，陈祈辉，夏梅珠.牛蛙“白内障”病病原及防治的研究［J］.福建水产，1995（2）：13-18.

［10］纪荣兴，邹文政，莫英军.牛蛙“白内障”病病原的初步研究［J］.集美大学学报（自然科学版），2003，8（1）：8-11.

（责任编辑：万晶）

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