食用栝楼种苗雌雄性别的DNA鉴定技术初步研究

2016-09-09金关荣骆霞虹杨晓伶王亦斌朱云国陈常理浙江省农业科学院花卉研究开发中心浙江杭州30同济大学生命科学与技术学院上海0009

浙江农业科学 2016年7期

关键词：栝楼雌雄条带

金关荣，程　舟，骆霞虹，杨晓伶，王亦斌，李　珊，朱云国，陈常理*（.浙江省农业科学院花卉研究开发中心，浙江杭州 30；.同济大学生命科学与技术学院，上海 0009）

金关荣1，程舟2，骆霞虹1，杨晓伶2，王亦斌2，李珊2，朱云国2，陈常理1*
（1.浙江省农业科学院花卉研究开发中心，浙江杭州 311202；2.同济大学生命科学与技术学院，上海 200092）

应用ISSR分子标记构建食用栝楼雌雄植株的DNA指纹图谱，获得与食用栝楼雌雄性别相关的分子标记，可准确、有效地鉴定食用栝楼种苗雌雄性别，为栝楼产业的可持续发展提供技术支撑。

食用栝楼；种苗；雌雄性别；ISSR；鉴定

文献著录格式：金关荣，程舟，骆霞虹，等.食用栝楼种苗雌雄性别的DNA鉴定技术初步研究［J］.浙江农业科学，2016，57（7）：1066-1068.

栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）是葫芦科（Cucurbitaceae）栝楼属（Trichosanthes L.）多年生草质藤本植物，其根、果实、果皮、种子均可入药，是我国的重要药用植物资源［1］。食用栝楼，又叫仁栝楼，俗称吊瓜，是野生栝楼的栽培种，其种子富含脂肪和蛋白质、味香爽口、油而不腻，具有较高的食用价值。目前，在长三角地区尤其是浙江省长兴、丽水、江苏省宜兴、常州等县市栝楼已广泛种植，仅长兴县今年的种植面积就近6 667 hm2，取得了良好的经济效益。

栝楼是雌雄异株植物，开花前雌、雄株间无明显的形态差异，雌雄株难辩。在栝楼栽培生产中雌、雄株的合理搭配在9∶1左右，而用种子繁殖栝楼时其幼苗的雌雄比例约为3∶7，目前产区多采用开花后人工去除雄株，以控制雌雄株比率。栝楼雌雄株比例失调直接影响产量和经济效益，不仅对土地、资源、人力等方面都造成较大浪费，而且已经成为制约食用栝楼产业发展的重要因素。

DNA指纹鉴定技术是近十几年发展起来的研究生物种群遗传多样性的有效技术，可对种、品种甚至个体间的微小差异进行有效的标记和鉴定，如限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增性酶切片段长度多态性（AFLP）和微卫星标记（SSR）等。这些方法由于具有灵敏、所需样品量少、不受材料外形的影响、直接检测样品的遗传物质DNA等特点，现已被广泛用于基因定位、医学鉴定以及种质资源的鉴定和保护等领域。特别是对于检测生物个体间的细微差别具有其他方法难以比拟的优越性。

ISSR（inter-simple sequence repeat）简单序列重复区间扩增多态性，是利用生物基因组中常出现的简单序列重复SSR（simple sequence repeat）设计引物，检测多态性的一种分子标记。ISSR分子标记技术具有操作简单、无须预先知道DNA序列、比RAPD标记更为灵敏、稳定且实验重复性好等优点［2-4］。

以往对栝楼的研究较少，仅对其生物学特性、栽培技术、病虫害防治、遗传多样性、内含物等方面有少量报道［3-7］，对栝楼雌雄株DNA鉴定的研究尚属空白。因此，本研究尝试应用ISSR分子标记构建栝楼雌雄植株的DNA指纹图谱，寻找与性别相关的分子标记，优化操作程序，建立准确、有效、实用的食用栝楼种苗雌雄性别鉴定技术，为栝楼产业的可持续发展提供技术支撑。

1　材料与方法

1.1材料

2005年5月在浙江省农业科学院花卉研究开发中心苗圃，从已知雌雄性别的3年生食用栝楼植株中选取6株雄株和10株雌株的新鲜叶片，用于DNA指纹图谱分析。另选已知雌雄性别的2年生食用栝楼种苗30株用于验证实验。

1.2基因组DNA的提取

取上述各栝楼植株的新鲜嫩叶0.2 g，用液氮研磨后转入离心管中，加入600μL预热的CTAB缓冲液（2%CTAB、1.4 mol·L-1NaC1、0.2%β-巯基乙醇、100 mmol·L-1Tris-HC1、20 mmol·L-1EDTA，pH值8.0），65℃保温1 h。加入600μL氯仿/异戊醇混合液（体积比24∶1），轻摇混匀5 min，室温12 000 r·m in-1离心10 min。取上清，加入500μL氯仿/异戊醇混合液（24∶1），轻摇混匀10 m in，12 000 r·m in-1离心10 m in。取上清，加入1/10体积的3 mol·L-1NaAc和2倍体积的预冷的无水乙醇，颠倒混匀后在-20℃中保存30 m in。10 000 r·min-1离心5 m in，取沉淀，用70%乙醇清洗，5 000 r·min-1离心5 min。取沉淀干燥后用100μL TE缓冲液（10 mmol·L-1Tris-HC1、1 mmol·L-1EDTA，pH值8.0）溶解，用0.7%的琼脂糖凝胶检测DNA质量。

1.3ISSR引物筛选和PCR扩增

选择雌雄各2株的4个DNA样品筛选14条ISSR引物，即The University of British Columbia（UBC）SSR Primer（RAPD）Synthesis Project Oligonucletide Set 100/9（表1）。反应体系20μL含2 mmol·L-1MgC12、0.25 mmol·L-1dNTPs、0.2μmol·L-1引物、10 ng模板、1×buffer和0.75 U Fx Taq DNA聚合酶（TaKaRa）。使用Eppendorf Mastercycler Gradient PCR仪进行扩增反应，扩增条件为94℃预变性5 min；40个循环：94℃变性45 s，48～55℃退火45 s（退火温度随引物变化见表1），72℃延伸45 s；最后72℃延伸10 min。

表1　本研究所用的ISSR引物

扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离（以100 V恒压电泳35 min），以100 bp DNA Ladder Plus（MBI Fermentas）作为分子量标准，用1μg· m L-1溴化乙啶染色后于UVP-GDS8000自动成像仪中拍照、观察、记录并保存电泳图片，构建栝楼雌雄植株的DNA指纹图谱。

2　结果与分析

2.1食用栝楼雌雄株的ISSR指纹图谱的构建

用已知雌雄性别的栝楼DNA样品从14条ISSR引物中筛选出8个扩增条带清晰、重复性好的引物，对所有样本进行扩增。其中引物826和861两条引物对已知雌雄性别的栝楼的DNA扩增结果表明，栝楼雌雄植株在ISSR指纹图谱上表现出明显的差异。在ISSR指纹图谱（引物826）上，栝楼雌株在2 100 bp处出现特征性条带，栝楼雄株则在1 100 bp处出现特征性条带（图1）。在ISSR指纹图谱（引物861）上，栝楼雌株在1 400和1 000 bp处出现特征性条带，栝楼雄株则在700 bp处出现特征性条带（图2）。根据栝楼雌雄株在ISSR指纹图谱上的特征性条带，可对栝楼种苗的雌雄性别进行早期鉴定。

图1　食用栝楼种苗雌雄植株的ISSR指纹图谱（引物826）

2.2食用栝楼种苗雌雄性别鉴定

根据构建的栝楼雌雄株的ISSR指纹图谱及其特征性条带，对栝楼种苗的雌雄性别鉴定的可靠性进行了验证实验，对已知雌雄性别的数十株栝楼种苗进行了DNA鉴定。图3展示的是用ISSR引物826扩增出的食用栝楼种苗（雌株）及对照样品栝楼雄株、雌株、野生株的指纹图谱，结果食用栝楼种苗雌雄性别鉴定100%成功。同样，用ISSR引物861扩增出的指纹图谱也可以成功鉴定食用栝楼种苗的雌雄性别（图2）。

3　小结

食用栝楼雌雄植株的ISSR-DNA指纹图谱差异明显，并获得与雌雄性别相关的特征性条带。根据已构建的栝楼雌雄植株的ISSR指纹图谱和特征性条带，可准确、有效地将栝楼种苗的雌雄性别鉴定出来。本研究结果为食用栝楼雌雄株的鉴别、雌雄株合理搭配供应及配比栽培提供技术保障，对栝楼产业的可持续发展具有重要意义及应用前景。