药敏试验扩散法比较分析

李雁萍，宋志勇

（山西省畜牧兽医学校，山西 太原 030024）

药敏试验扩散法比较分析

李雁萍，宋志勇

（山西省畜牧兽医学校，山西 太原 030024）

药敏试验是指细菌对抗菌药物的敏感性试验，通过药敏试验，能很好地掌握药物对细菌的敏感性，为临床选用抗菌药物提供理论参考，以便准确有效地利用药物进行预防治疗。常用方法有纸片法、牛津杯法和打孔法等。通过对大肠杆菌的药敏试验，氧氟沙星、氟甲喹、新霉素为高敏，硫氰酸红霉素、林可霉素为中敏。

抗菌药；药敏试验；扩散法；比较

抗菌药对细菌性传染病的预防、控制起到非常重要的作用，但因盲目、滥用抗菌药，致使很多致病性细菌产生了耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖场（户）造成了很大的经济损失，给养殖业带来很大的困惑［1］。通过药敏试验，能很好地掌握药物对细菌的敏感性，为临床选用抗菌药物提供理论参考，以便准确有效的利用药物进行预防治疗［2］。笔者从事实验工作30年，临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要是扩散法，现将三种扩散法的具体操作及试验结果介绍总结如下，供大家临床用药参考。

1　材料和方法

1.1原理

药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而形成浓度梯度，由于抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC（最小抑菌浓度）呈负相关［3］。

1.2材料

1.2.1菌种

临床现场采取大肠。

1.2.2抗生素和抗菌药

选用氧氟沙星可溶性粉（编号为1）、硫氰酸红霉素可溶性粉（编号为2）、盐酸林可霉素可溶性粉（编号为3）、氟甲喹可溶性粉（编号为4）、硫酸新霉素可溶性粉（编号为5）5种抗菌药进行对比试验。

1.3方法

1.3.1纸片法

将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上。

1.3.1.1纸片制备

取定性滤纸，用打孔机打成6 mm直径的圆形小纸片。取圆纸片200片分5份分别装入清洁干燥的5个青霉素空瓶中，瓶口以报纸包扎。经15磅15～2 min高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥备用。

1.3.1.2药液的制备（用于商品药的试验）

挑选可溶性粉剂氧氟沙星（编号为1）、硫氰酸红霉素（编号为2）、林可霉素（编号为3）、氟甲喹（编号为4）、新霉素（编号为5），按商品药治疗量的10倍的比例配制药液。

1.3.1.3药敏片的准备

在上述含有40片纸片的5个青霉素瓶内分别加入氧氟沙星可溶性粉（编号为1）、硫氰酸红霉素可溶性粉（编号为2）、盐酸林可霉素可溶性粉（编号为3）、氟甲喹可溶性粉（编号为4）、硫酸新霉素可溶性粉（编号为5）的0.1%药液10 ml，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液。翻动纸片时不能将纸片捣烂，同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3～6个月。

1.3.1.4普通营养琼脂培养基

称取琼脂培养基22.5 g，加入500 ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，培养皿分装，在培养皿的皿底划十字形，标号（与抗菌药物编号一致），消毒，备用。

1.3.1.5菌种的挑选、培养

将临床症状和剖检变化疑似大肠杆菌病的鸡或猪的肝、脾、心脏，先用灼烧的手术剪在肝或心脏表面烙烫一下，剪取病料如肝、脾、心脏剪小块直接放入肉汤培养基中，置于37℃恒温箱中培养24 h进行培养，备用。

1.3.1.6操作步骤

第1步，在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的镊子夹取消毒棉，蘸取待检细菌混悬液，涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密，涂好的培养皿放入37℃恒温箱中20～30 min，效果更好。

第2步，将消毒镊子夹取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。药敏片有规律地贴于平皿培养基上，每种药敏片要与相应的编号对应，每组重复3次，结果取平均值。

第3步，将平皿培养基置于37℃温箱中培养24 h后，观察效果。

1.3.2牛津杯法

在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的镊子夹取消毒棉，蘸取待检细菌混悬液，涂布于平皿培养基表面。操作、要求同纸片法。

无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6 mm、外径8 mm、高10 mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用塑料管、玻璃管、瓷管代替），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。

15 min后分别向各小管中滴加和药敏片一样量（25 μL）的各种药液，每组重复3次，结果取平均值。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养24 h后，观察效果。

1.3.3打孔法

在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的镊子夹取消毒棉，蘸取待检细菌混悬液，涂布于平皿培养基表面。操作、要求同纸片法。

无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4 mm、孔径与孔距均为3 mm，管的两端要光滑，也可用塑料管、玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

待15 min后，分别向各孔中滴加和药敏片一样量（25 μL）的各种药液。每组重复3次，结果取平均值。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养24 h后，观察效果。

1.3.4判定标准

药敏试验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

表1　药物敏感试验判定标准

2　结果观察

运用扩散法进行药敏试验，结果显示如下表。

药物敏感试验判定标准参考表1，氧氟沙星（编号为1）、氟甲喹（编号为4）、新霉素（编号为5）；在20 mm以上均为高敏；硫氰酸红霉素（编号为2）、林可霉素（编号为3）在10～14 mm均为中敏。

表2　药物敏感试验结果

3　结论与体会

3.1结论

通过纸片法、牛津杯法和打孔法对大肠杆菌的药敏试验，可得出以下结论：

打孔法不需要制作或购买药敏片，也不用购买牛津杯，成本低，适合生产中应用。打孔法3组对比，结果整齐，误差小。打孔法直接打孔后，将药液滴入即可。

由此可见，打孔法操作简单，成本低，准确率高，适合商品药敏感度的测定。

3.2影响药敏试验的因素

3.2.1培养基

溶解培养基要用蒸馏水，一些离子如Ca2+、Mg2+、Al3+等，一定程度上影响药敏试验的结果。

细菌药敏试验的培养基厚度大约为4 mm，若培养基厚度大于4 mm，会使细菌出现耐药；若小于4 mm，本应耐药的易出现敏感，这一点很关键［4］。

3.2.2试纸片的影响

药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的滤纸，药敏纸片的厚度要求大约1 mm，这样才有利于细菌的生长和药物的扩散速度。药敏纸片的直径在6.00～6.35 mm之间，纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。

做好的纸片应放低温下（-10℃）保存，同时要避免潮湿，以保持抗菌药物的活性。盛纸片小瓶自低温处取出应在室温平衡至少10min后再打开，避免冷凝水影响药效。

3.2.3细菌菌株的影响

由于各种菌对药物的敏感性不同，产生的抑菌环大小不同，如果菌种不纯，试验中所产生的抑菌环大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌环大小存在较大的差异，影响判断结果的准确性。因此需要对各种致病菌提纯后，分别进行不同的药敏试验。药敏试验时，需要将提纯后的菌种配制成一定浓度的菌液。WHO组织制定的标准是要求菌液浓度在1.5亿/mL左右。若菌液浓度过高，该菌会对所有药物产生耐药；反之，菌液浓度过低，该菌会对所有药物均敏感。

药敏试验中要将菌液均匀地涂在培养基上，使细菌均匀分布，这样才能使试验结果不会出现较大的偏差。涂菌后15 min才能贴药敏纸片。由于涂菌后，细菌要有一段时间的适应过程，但是时间不能过长，否则会使细菌产生耐药。贴药敏纸片时，每取一种药敏纸片必须烧一下镊子口，避免药敏纸片之间相互混淆，以提高药敏的准确性。药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大［4］。

3.2.4培养时间的影响

一般培养温度和时间为37℃8～18h，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2～4 h，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈［4］。

3.3药敏试验的应用

药物敏感试验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果。

［1］陈学文.兽医临床上滥用抗生素的危害［J］.当代畜牧，2014（27）：56～57.

［2］唐光武等.禽病快速诊断指南［M］.河南：和囔科学技术出版社，2008.4：43.

［3］倪语星.抗微生物药物敏感性试验规范［M］上海：上海科学技术出版社，2002.10：16.

［4］佚名.影响药敏试验的因素［J］.北方牧业，2004（14）：19～19.

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1004-5090（2016）07-0010-03

2016-04-29）