Toll样受体4与胰腺癌PANC1细胞对吉西他滨敏感性的关系

孙运良　虞阳　童依丽　吴洪玉　马建霞



Toll样受体4与胰腺癌PANC1细胞对吉西他滨敏感性的关系

孙运良虞阳童依丽吴洪玉马建霞

目的观察Toll样受体4(TLR4)与胰腺癌PANC1细胞对吉西他滨(GEM)敏感性的关系，探讨其相关机制。 方法将PANC1细胞分为GEM组、脂多糖(LPS)+GEM组、TLR4-siRNA+GEM组。GEM组给予GEM处理，LPS+GEM组先用1 mg/L的LPS干预4 h后再用GEM处理，TLR4-siRNA+GEM组先用100 pmol/ml TLR4-siRNA转染细胞4 h后再用GEM处理。以不做任何处理的细胞作为对照组。采用MTT法检测各组细胞的增殖，Hoechst33258染色观察细胞形态学变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率，蛋白质印迹法检测细胞TLR4、磷酸化AKT(p-AKT)、活性Caspase-3蛋白表达。结果GEM组、LPS+GEM组、TLR4-siRNA+GEM组GEM对PANC1细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为(8.90±0.62)、(14.21±0.95)、(3.96±0.27)mg/L，LPS+GEM组显著高于GEM组，TLR4-siRNA+GEM组显著低于GEM组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。LPS+GEM组典型凋亡形态学改变的细胞数较GEM组减少，而TLR4-siRNA+GEM组则较GEM组增多；对照组、GEM组、LPS+GEM组、TLR4-siRNA+GEM组细胞凋亡率分别为(2.1±0.3)%、(15.1±2.3)%、(9.8±1.5)%、(22.9±3.1)%，LPS+GEM组显著低于GEM组，TLR4-siRNA+GEM组显著高于GEM组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。4组的TLR4表达量分别为0.83±0.08、0.81±0.07、0.85±0.07、0.16±0.03；p-AKT表达量为0.61±0.05、0.36±0.03、0.73±0.07、0.21±0.02；活性Caspase-3表达量为0.66±0.05、0.73±0.07、0.45±0.04、0.91±0.07。TLR4-siRNA+GEM组的TLR4、p-AKT表达均较GEM组显著下降(P值均<0.01)，而活性Caspase-3表达显著增高(P<0.05)。LPS+GEM组的p-AKT表达较GEM组显著增加(P<0.01)，而活性Caspase-3蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论TLR4可抑制胰腺癌PNAC1细胞对GEM的敏感性，其机制可能与激活PI3K/AKT通路，下调活性Caspase-3表达有关。

胰腺肿瘤；Toll样受体4；抗药性，肿瘤；吉西他滨；磷酸化AKT；活性Caspase-3

Fund program：Excellent Youth Physicians of Shanghai HuaDong Hospital(HDGG2014003)；Scientific Research Project of Lianyungang Municipal Planning Commission(1427)

吉西他滨(gemcitabine，GEM)是目前治疗中晚期胰腺癌的一线化疗药物，但胰腺癌是耐药性很强的肿瘤，GEM单药治疗对延长胰腺癌患者生存期的效果并不令人满意[1-3]，因此从分子水平上研究胰腺癌化疗耐药的相关机制，寻找新的治疗靶点，以期提高胰腺癌的化疗敏感性受到了学者的广泛关注。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)已被证实在肿瘤细胞呈高表达，与多种肿瘤的发生、发展密切相关[4-5]。近年来的研究还表明，TLR4的异常表达参与肿瘤细胞的化疗耐药[6-8]。本课题组前期研究发现TLR4在胰腺癌呈高表达，且与胰腺癌的侵袭和转移有关[9]。但有关TLR4是否参与胰腺癌对吉西他滨化疗耐药的研究较少。本研究通过TLR4的配体脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)干预及采用特异性siRNA沉默TLR4基因表达的方法观察胰腺癌PANC1细胞对GEM敏感性的变化，并探讨相关机制。

材料和方法

一、材料

人胰腺癌细胞株PANC1购自美国ATCC公司。GEM为法国Llilly公司产品，PBS稀释后备用。LPS为Sigma公司产品。靶向TLR4的siRNA(TLR4-siRNA)正义序列5′-CUUUAUCCAACCAGGUGCAUUUU-3′，反义序列5′-AAUGCACCUGGUUGGAUAAAGUU-3′，由上海吉玛生物技术有限公司合成。Hoechst 33258、AnnexinV FITC细胞凋亡检测试剂盒购自江苏碧云天公司。磷酸化AKT(p-AKT)单抗为美国Cell Signaling Technology公司产品，抗TLR4、活性Caspase-3(经过系列反应被激活的Caspase为活性Caspase)多抗购自Santa Cruz公司。

二、方法

1．细胞培养及TLR4-siRNA转染：PANC1细胞置含有10% FBS、青霉素及链霉素各100 U/ml的DMEM培养液中在37℃、5% CO2条件下培养、传代。取对数生长期细胞，以每孔1×106个细胞加入6孔板，培养过夜待细胞贴壁。将100 pmol TLR4-siRNA加入到100 μl的无血清DMEM培养液混匀，用100 μl无血清DMEM加5 μl lipofectamin2000轻轻混匀后室温放置5 min，将稀释好的TLR4-siRNA、lipofectamin2000试剂轻柔混匀后室温放置20 min以形成TLR4-siRNA/lipofectamin复合物。弃去6孔板各孔培养液，加入200 μl TLR4-siRNA/lipofectamin复合物和800 μl无血清DMEM培养液继续培养4 h以获取转染TLR4-siRNA的PANC1细胞。

2．MTT法检测细胞增殖：收集对数生长期PANC1细胞，以每孔5×103个细胞加入96孔板。待细胞贴壁后更换为无血清的DMEM培养液。实验分为GEM组、LPS+GEM组、TLR4-siRNA+GEM组，每组6个复孔。GEM组分别加入终浓度为0.01、0.1、1、10 mg/L的GEM；LPS+GEM组先用1 mg/L的LPS干预细胞4 h，弃去培养液，再分别加入上述不同浓度的GEM； TLR4-siRNA+GEM组先用100 pmol/ml的TLR4-siRNA转染细胞4 h，弃去培养液，再分别加入上述不同浓度的GEM。以不做任何处理的PANC1细胞作为对照组。各组细胞常规培养48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5mg/ml)继续培养4 h，吸去孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，置摇床上低速振荡10 min，上酶联免疫检测仪测各孔在波长570 nm处的吸光度值(A570值)。细胞生长抑制率=1-(实验组A570值/对照组A570值)×100%。实验重复3次，取均值。

3．Hoechst33258染色法观察细胞形态变化：取对数生长期PANC1细胞，以每孔5×105个细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后同样分为上述3组，但GEM浓度只有1 mg/L，以不做任何处理的细胞作为对照组。培养24 h后弃去培养液，PBS洗涤3次，用4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS冲洗细胞3次，加入Hoechst33258室温避光染色10 min，置荧光显微镜下观察细胞形态变化。

4．流式细胞仪检测细胞凋亡：取上述培养24 h的4组细胞，上流式细胞仪检测细胞凋亡。严格按Annexin V-FITC试剂盒说明书操作。

5．蛋白质印迹法检测细胞TLR4、p-AKT、活性Caspase-3蛋白表达：取上述培养24 h的4组细胞，用RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取各组细胞总蛋白，应用蛋白分析系统(Bio-Rad)测定蛋白浓度，常规行蛋白质印迹法检测蛋白表达，以β-actin为内参。抗TLR4、p-AKT、Caspase-3抗体工作浓度1∶500，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗工作浓度1∶5 000，最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。应用凝胶图像软件分析系统对胶片扫描，以目的条带与内参条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

三、统计学处理

结　　果

一、各组PANC1细胞增殖的变化

随着GEM浓度的增加，LPS+GEM组对PANC1细胞抑制率较GEM组显著下降，而TLR4-siRNA+GEM组的抑制率较GEM组显著增高，差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01，图1)。GEM组、LPS+GEM组、TLR4-siRNA+GEM组GEM对PANC1细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为(8.90±0.62)、(14.21±0.95)、(3.96±0.27)mg/L，LPS+GEM组显著高于GEM组，TLR4-siRNA+GEM组显著低于GEM组，差异均有统计学意义(t=11.438，P<0.01；t=17.927，P<0.01)。

图1　GEM组、LPS+GEM组、TLR4-siRNA+GEM组PANC1细胞的生长抑制率曲线

二、各组PANC1细胞凋亡的变化

荧光显微镜下对照组细胞未见明显凋亡的形态学改变；GEM组、LPS+GEM组、TLR4-siRNA+GEM组细胞均出现不同程度的细胞核浓缩以及凋亡小体形成等典型的细胞凋亡形态学改变。LPS+GEM组典型凋亡形态学改变的细胞数较GEM组减少，而TLR4-siRNA+GEM组则较GEM组增多(图2)；对照组、GEM组、LPS+GEM组、TLR4-siRNA+GEM组细胞凋亡率分别为(2.1±0.3)%、(15.1±2.3)%、(9.8±1.5)%、(22.9±3.1)%。LPS+GEM组细胞凋亡率较GEM组显著减少，而TLR4-siRNA+GEM组较GEM组显著增加，差异均有统计学意义(t=3.384，P<0.05；t=4.451，P<0.01，图3)。

图2　对照组(2A)、GEM组(2B)、LPS+GEM组(2C)、TLR4-siRNA+GEM组(2D)PANC1细胞的形态变化(荧光显微镜　×200)

图3　对照组(3A)、GEM组(3B)、LPS+GEM组(3C)、TLR4-siRNA+GEM组(3D)PANC1细胞的凋亡

三、各组PANC1细胞TLR4、p-AKT、活性Caspase-3蛋白表达的变化

对照组、GEM组、LPS+GEM组、TLR4-siRNA+GEM组细胞TLR4表达量分别为0.83±0.08、0.81±0.07、0.85±0.07、0.16±0.03；p-AKT表达量为0.61±0.05、0.36±0.03、0.73±0.07、0.21±0.02；活性Caspase-3表达量为0.66±0.05、0.73±0.07、0.45±0.04、0.91±0.07(图4)。TLR4-siRNA+GEM组的TLR4、p-AKT蛋白表达均较GEM组显著下降，活性Caspase-3蛋白表达显著增高(t=16.304，P<0.01；t=7.273，P<0.05；t=2.935，P<0.01)； LPS+GEM组p-AKT蛋白表达较GEM组显著增加，活性Caspase-3蛋白表达显著减少(t=8.748，P<0.01；t=5.852，P<0.01)，而TLR4蛋白表达与GEM组间的差异无统计学意义。

讨　　论

TLRs是Toll基因所编码的一类跨膜受体蛋白，其中TLR4是目前研究相对较为成熟的TLR家族成员。在TLR4信号转导途径中，LPS是TLR4的配体，它可识别并结合TLR4，进而产生信号转导，诱导宿主发生免疫防御反应。目前的研究证实，TLR4除了在免疫细胞表达外，还在肿瘤细胞高表达，与结肠癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤的发生、发展密切相关。Wang等[4]报道，TLR4在肝癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，且LPS能够促进肝癌细胞株HL-7702、PLC/PRF/5的增殖。Hsu等[5]报道，TLR4在结肠癌细胞中显著高表达，且与肿瘤细胞的肝转移密切相关。

图4　对照组(1)、GEM组(2)、LPS+GEM组(3)、TLR4-siRNA+GEM组(4)PANC1细胞TLR4、p-AKT、活性Caspase-3蛋白表达

近年来，越来越多的的证据表明，TLR4的异常表达除了与肿瘤的发生、发展有关，还参与多种肿瘤细胞对化疗药物的耐药作用。Zhang等[6]报道，通过LPS激活TLR4表达后，前列腺癌细胞PC-3对多西他赛的化疗敏感性明显下降；而通过siRNA干扰下调TLR4表达后，PC-3细胞对多西他赛的化疗敏感性显著增高。Sun等[7]的研究结果表明，TLR4在人口腔鳞状细胞癌组织中高表达，且高表达的TLR4与口腔鳞状细胞癌对顺铂的化疗耐药有关。此外有研究证实，紫杉醇也是TLR4的重要配体，它可通过激活TLR4信号通路，诱导多种细胞因子及抗凋亡分子表达增加，从而降低肿瘤细胞对紫杉醇的化疗敏感性[8]。本研究结果显示，经LPS激活TLR4后，GEM对PANC1细胞的IC50显著升高，而凋亡细胞数和细胞凋亡率显著下降；应用TLR4-siRNA沉默TLR4表达后，GEM对PANC1细胞的IC50显著降低，而凋亡细胞数和细胞凋亡率显著增加，同样表明TLR4可抑制胰腺癌细胞对GEM的敏感性。

PI3K/AKT通路广泛存在于各种细胞，是参与细胞生长、增殖、分化调节的信号转导通路。AKT是PI3K下游直接的靶蛋白，具有丝氨酸/苏氨酸残基，可直接被PI3K激活；p-AKT是AKT的功能活化状态。目前已证实，PI3K/AKT通路在多种肿瘤细胞内呈持续激活状态，持续激活的PI3K/AKT通路可诱导VEGF以及IL-8等细胞因子的产生，从而促进肿瘤发生与发展。经LPS激活TLR4蛋白后可促进AKT的磷酸化，激活PI3K/AKT通路，促进肿瘤细胞的生长；而使用RNA干扰技术沉默TLR4基因表达后可抑制PI3K/AKT通路，促进肿瘤细胞的凋亡[10-12]。本研究结果显示，LPS+GEM组胰腺癌PANC1细胞p-AKT的表达较GEM组显著增加，而TLR4-siRNA+GEM组在抑制TLR4表达的同时导致p-AKT表达较GEM组显著减少，提示TLR4具有激活胰腺癌细胞PI3K/AKT通路的作用。

Caspase是一类半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，通常以无活性的酶原形式存在于细胞胞质中，经过系列反应被激活后可参与切割细胞内多种底物，从而导致细胞凋亡。活化的Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。研究显示，抑制Caspase-3活化是PI3K/AKT促肿瘤的重要机制；阻断PI3K/AKT通路可上调活性Caspase-3表达，促进肿瘤细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的[13]。本研究结果显示，与GEM组相比，LPS+GEM组活性Caspase-3表达显著减少， TLR4-siRNA+GEM组活性Caspase-3表达则显著增加，提示TLR4具有抑制Caspase-3活化的作用，其机制可能与激活PI3K/AKT通路有关。

总之，异常表达的TLR4在胰腺癌PNAC1细胞对GEM的化疗耐药过程中起重要作用，其机制与激活PI3K/AKT通路，抑制Caspase-3活化有关。

[1]Von Hoff DD, Ramanathan RK, Borad MJ, et al. Gemcitabine plus nab-paclitaxel is an active regimen in patients with advanced pancreatic cancer: a phase I/II trial[J]. J Clin Oncol, 2011, 29(34): 4548-4554. DOI: 10.1200/JCO.2011.36.5742.

[2]张太平,曹喆,赵玉沛.胰腺癌的化疗与放疗[J].中华消化外科杂志,2015,14(8):619-622.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-9752.2015.08.006.

[3]杨尹默.胰腺癌外科治疗的热点与难点[J].中华消化外科杂志,2015,14(8):612-614.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-9752.2015.08.004.

[4]Wang L, Zhu R, Huang Z, et al. Lipopolysaccharide-induced toll-like receptor 4 signaling in cancer cells promotes cell survival and proliferation in hepatocellular carcinoma[J]. Dig Dis Sci, 2013, 58(8): 2223-2236. DOI: 10.1007/s10620-013-2745-3.

[5]Hsu RY, Chan CH, Spicer JD, et al. LPS-induced TLR4 signaling in human colorectal cancer cells increases beta1 integrin-mediated cell adhesion and liver metastasis[J]. Cancer Res, 2011, 71(5): 1989-1998. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-10-2833.

[6]Zhang Y, Wang Y, Yuan J, et al. Toll-like receptor 4 ligation confers chemoresistance to docetaxel on PC-3 human prostate cancer cells[J]. Cell Biol Toxicol, 2012, 28(4): 269-277. DOI: 10.1007/s10565-012-9221-2.

[7]Sun Z, Luo Q, Ye D, et al. Role of toll-like receptor 4 on the immune escape of human oral squamous cell carcinoma and resistance of cisplatin-induced apoptosis[J]. Mol Cancer, 2012, 11:33. DOI: 10.1186/1476-4598-11-33.

[8]Rajput S, Volk-Draper LD, Ran S. TLR4 is a novel determinant of the response to paclitaxel in breast cancer[J]. Mol Cancer Ther, 2013, 12(8):1676-1687. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-12-1019.

[9]孙运良, 满晓华, 王丽华, 等. Toll样受体-4与胰腺癌侵袭和转移的关系[J]. 中国癌症杂志, 2012, 22(7): 522-527. DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.008.

[10]Li D, Jin Y, Sun Y, et al. Knockdown of toll-like receptor 4 inhibits human NSCLC cancer cell growth and inflammatory cytokine secretion in vitro and in vivo[J]. Int J Oncol, 2014,45(2):813-821. DOI: 10.3892/ijo.2014.2479.

[11]Doan HQ, Bowen KA, Jackson LA, et al. Toll-like receptor 4 activation increases Akt phosphorylation in colon cancer cells[J]. Anticancer Res, 2009, 29(7):2473-2478.

[12]Wu Y, Zhao Q, Peng C, et al. Neutrophils promote motility of cancer cells via a hyaluronan-mediated TLR4/PI3K activation loop[J]. J Pathol, 2011, 225(3):438-447. DOI: 10.1002/path.2947.

[13]Yang ZP, Zhao Y, Huang F, et al. Equol inhibits proliferation of human gastric carcinoma cells via modulating Akt pathway[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(36):10385-10399. DOI: 10.3748/wjg.v21.i36.10385.

(本文编辑：屠振兴)

Relationship between TLR4 and the sensitivity of pancreatic cancer PANC1 cells to gemcitabine

SunYunliang,YuYang,TongYili,WuHongyu,MaJianxia.

DepartmentofGastroenterology,ThePeople′sHospitalofGanyuCounty,Lianyungang222100,China

Correspondingauthor:MaJianxia,Email:yz_mjx@163.com

ObjectiveTo observe the relationship between Toll-like receptor 4 (TLR4) and the sensitivity of PANC1 cells to gemcitabine (GEM), and to analyze the potential mechanism. MethodsPANC1 cells were divided into GEM group, lipopolysaccharide (LPS)+GEM group and TLR4-siRNA+GEM group. GEM group was treated by GEM alone. LPS+GEM group was pretreated with 1 mg/L LPS for 4 h and then treated by GEM. TLR4-siRNA+GEM group was transfected with 100 pmol/mL TLR4-siRNA for 4 h and then treated by GEM. The untreated cells were used as the control group. MTT method was used to detect the cell proliferation. Morphological changes and apoptosis rate of the cells were examined by Hoechst33258 staining and flow cytometry, respectively. The protein expression of TLR4, phosphorylated AKT (p-AKT) and activated Caspase-3 were detected by Western blot. ResultsThe median inhibition concentration (IC50) of GEM in the GEM group, LPS+GEM group and TLR4-siRNA+GEM group was (8.9±0.32), (14.21±0.95), (3.96±0.27)mg/L, respectively. The IC50in LPS+GEM group was significantly higher than that in GEM group (P<0.01), and the IC50of GEM in TLR4-siRNA+GEM group was significantly lower than that in GEM group (P<0.01). Compared with that in GEM group, the cells with typical apoptotic morphological changes were decreased in LPS+GEM group, which was increased in TLR4-siRNA+GEM group. The apoptotic rate in control group, GEM group, LPS+GEM group, TLR4-siRNA+GEM group was (2.1±0.3)%, (15.1±2.3)%, (9.8±1.5)%, (22.9±3.1)%, respectively. Compared with that in GEM group, the cells apoptotic rate was significantly reduced in LPS+GEM group (P<0.01), which was significantly increased in TLR4-siRNA+GEM group (P<0.01). TLR4 protein level in the 4 groups was 0.83±0.08, 0.81±0.07, 0.85±0.07 and 0.16±0.03; p-AKT protein level 0.61±0.05, 0.36±0.03, 0.73±0.07 and 0.21±0.02; activated Caspase-3 protein level was 0.66±0.05, 0.73±0.07, 0.45±0.04 and 0.91±0.07, respectively. The expression of TLR4 and p-AKT in TLR4-siRNA+GEM group was significantly lower than that in GEM group (P<0.01), while the expression of activated Caspase-3 protein was increased significantly (P<0.05). Compared with the GEM group, the expression of p-AKT protein in LPS+GEM group was significantly increased (P<0.01), and the expression of activated Caspase-3 protein was significantly decreased (P<0.01). ConclusionsTLR4 can inhibit the sensitivity of pancreatic cancer PNAC1 cells to GEM, and the mechanism is related to the activation of PI3K/AKT pathway and down-regulation of activated Caspase-3.

Pancreatic neoplasms;Toll-like receptor 4;Drug resistance, neoplasm;Gemcitabine;Phosphorylated AKT;Activated Caspase-3

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.04.003

222100江苏连云港，江苏省连云港市赣榆区人民医院消化内科(孙运良)；上海复旦大学附属华东医院消化内科(虞阳、童依丽、马建霞)；第二军医大学长海医院消化内科(吴洪玉)

马建霞，Email：yz_mjx@163.com

上海复旦大学华东医院骨干基金(HDGG2014003)；连云港市卫计委科研项目(1427)

2016-01-25)