TW-37调节NF-κB信号通路抑制体外胰腺癌细胞转移的实验研究

吴隆超　王琳娜　刘瑞东　王晓丽　田文霞　李兴涛　张俊



TW-37调节NF-κB信号通路抑制体外胰腺癌细胞转移的实验研究

吴隆超王琳娜刘瑞东王晓丽田文霞李兴涛张俊

目的观察TW-37干预对胰腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭及血管生成的影响，探讨其可能机制。方法应用TW-37干预胰腺癌细胞株BxPC3和HPAC，以转染NF-κB p65 cDNA(p65 cDNA)、靶向NF-κB p65的siRNA(siRNA-p65)细胞及未干预细胞作为对照组。采用MTT和ELISA法检测细胞增殖和细胞凋亡；应用Transwell小室检测细胞侵袭能力；采用体外人脐静脉内皮细胞(HUVECs)成管实验观察细胞培养上清对血管生成的影响；ELISA法检测细胞NF-κB活性；蛋白质印迹法检测细胞NF-κB靶向调节蛋白VEGF、MMP-9表达。结果TW-37呈浓度和时间依赖性抑制BxPC3、HPAC细胞的增殖，诱导两株细胞的凋亡(A405值1.29±0.21比0.09±0.01，1.07±0.18比0.08±0.01)，抑制细胞NF-κB活性及NF-κB p65、VEGF、MMP-9蛋白表达，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。对照组、0.75 μmol/L TW-37干预组的穿膜细胞数分别为(46.7±5.24)、(10.3±1.26)个/200倍视野；HUVECs形成的血管数分别为(39.4±4.36)、(7.84±1.25)个/200倍视野，差异均有统计学意义(P值均为0.001)。转染p65 cDNA 的两株细胞的NF-κB活性较对照组显著增加，用TW-37干预后NF-κB活性下降；转染siRNA-p65的两株细胞的NF-κB活性较对照组显著下降，用TW-37干预后NF-κB活性进一步下降，差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01)。转染p65 cDNA对两株细胞凋亡无明显影响，用TW-37干预后凋亡略有变化；转染siRNA-p65的两株细胞凋亡显著增加，用TW-37干预后又进一步增加，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。结论TW-37通过NF-κB抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和血管生成，诱导细胞凋亡。

胰腺肿瘤；生长；肿瘤转移；病理性血管生成；TW-37

μmol/L TW-37 group (P=0.001). The number of tube formation was (39.4±4.36) and (7.84±1.25)/×200, (P=0.001). NF-κB activity was increased by p65 cDNA transfection, and decreased by TW-37 treatment in both of the two cell lines (P<0.05). However, NF-κB activity was decreased by p65 siRNA transfection, and greatly decreased by TW-37 treatment in both two cell lines (P<0.05 orP<0.01). Transfection of p65 cDNA did not significantly affect cell apoptosis. Transfection of p65 siRNA increased cell apoptosis, and greatly increased by TW-37 treatment in both two cell lines (allP<0.01). ConclusionsTW-37 could inhibit the proliferation, invasion and angiogenesis in pancreatic cancer cells by regulating NF-κB signal pathway.

胰腺癌是极易侵袭和转移的恶性肿瘤，传统的治疗手段疗效差，因此基因治疗胰腺癌是目前研究的热点[1]。Bcl-2在胰腺癌组织过度表达，激活NF-κB，发挥抗凋亡和促胰腺癌细胞转移作用[2-3]。文献报道[4]，应用RNA干扰技术抑制胰腺癌细胞Bcl-2表达能显著抑制胰腺癌细胞的生长和侵袭能力，提示Bcl-2可能是胰腺癌基因治疗的有效靶点。TW-37是近年来发现的Bcl-2的小分子抑制剂，它对多种肿瘤细胞的生长和转移都有明显的抑制作用[5]。本研究观察TW-37对胰腺癌细胞生长、转移和血管生成的影响，探讨TW-37的作用机制。

材料与方法

一、蛋白质印迹法检测细胞Bcl-2、NF-κBp65、MMP-9、VEGF蛋白表达

胰腺癌AsPC1、BxPC3、HPAC和PANC1细胞购自中科院上海细胞研究所。收集各组细胞，使用Epigentek公司的蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白并分离核蛋白，按照试剂盒说明书操作。采用蛋白质印迹法检测细胞Bcl-2、NF-κB p65(p65)、MMP-9、VEGF蛋白表达，以GAPDH为内参。鼠抗人p65、Bcl-2 、MMP-9、VEGF一抗工作浓度分别为1∶200、1∶150、1∶200、1∶200，碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG工作浓度1∶5 000。应用北京赛智创业科技有限公司 ChampGelTM3-4软件进行图像定量分析。

二、电泳迁移率改变分析(EMSA)法检测NF-κB活性

取siRNA-p65、p65 cDNA转染24 h后的BxPC3细胞，再应用0.25、0.75 μmol/L TW-37(上海赛鑫生物科技有限公司)干预48 h，同时设单纯转染组、单纯TW-37干预组及未转染未干预的对照组。用预冷的PBS(pH7.2)反复冲洗以收集细胞，常规离心后再用PBS洗1次。加缓冲液A 100 μl重悬细胞，置冰浴15 min，再加10% NP 40 μl，涡动10 s，4℃ 3 000 g离心5 min，取上清液(胞质提取物)，移至新试管，分别加pH7.9的HEPEs(10 mmol/L)及终浓度为40、150 μmol/L的KCl，冰浴孵育30 min，13 000 g离心30 min。收集上清液(胞质蛋白)，Lowery法定量蛋白后置-80℃备用。沉淀用低渗缓冲液洗后重悬于适量低盐缓冲液中，然后逐滴加入等量高渗缓冲液，4℃孵育30 min，间歇震荡，最后4℃ 13 000 g离心30 min，收集上清液(核蛋白)，Lowery法定量蛋白后置-80℃备用。探针NF-κB寡核苷酸序列为5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′及5′-GCCTGGGAAATCCCCTCAACT-3′，由生工生物工程有限公司合成，应用T4多聚核酸酶(Roche Applied Science公司)将4 μl γ-[32P]-ATP(上海岚派生物科技有限公司)标记到双链寡核苷酸上，按说明书操作。每个反应体系含Nuclease-Free Water 5 μl，EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2 μl，细胞核蛋白2 μl，l μl标记的寡核苷酸探针，混合后经含40%甘油的凝胶电泳分离，然后压片，置-70℃曝光12 h后显影。以不加细胞核蛋白作为对照组。

三、ELISA法检测p65蛋白的结合活性

取亲和素包被的96孔ELISA板，加33 nmol/L生物素化dsDNA(含NF-κB p65亚基结合的共有序列)，室温孵1 h。洗涤后用含3%脱脂牛奶的转录因子缓冲液封闭1 h，洗涤后每孔分别加50 μl各组核蛋白提取液,室温下孵育1 h，洗涤后加入兔抗人NF-κB抗体，室温下孵育1 h，洗涤后加HRP标记的羊抗兔IgG(BD Transduction Labs)，室温下孵育30 min，洗涤后加100 μl TMB显色，上酶标仪检测各孔在波长450 nm的吸光度值(A450值)。根据标准品的A450值绘制标准曲线，计算NF-κB亚单位p65的结合活性。

四、MTT 法检测细胞增殖

AsPC1、BxPC3、HPAC和PANC1细胞采用RPMI 1640培养基+10%灭活小牛血清常规传代。取对数生长期细胞，以每孔5×103个细胞密度接种于96孔培养板，培养24 h后每孔分别加入0.25、0.5、0.75 μmol/L TW-37继续培养24、48、72 h，以无血清DMEM代替TW-37作为对照组。培养到时间点后加入0.5 mg/ml MTT 20 μl (Sigma公司)继续孵育2 h，离心弃上清，加入DMS 0.2 ml，吹打后上酶标仪测各孔570 nm处的吸光度值(A570值)。每样本设3个复孔，每个实验重复3次，取均值。绘制细胞生长曲线。

五、ELISA法检测细胞凋亡

取上述各组对数生长期细胞，1 000 r/min离心10 min，取上清(细胞释放的单/低聚核小体片段)20 μl加入链霉亲合素包被的培养板孔中，另加入80 μl免疫反应试剂(抗-DNA-POD、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液以1∶1∶18混合)，室温置摇床上(250 r/min) 孵育2 h，弃上清，用300 μl温育缓冲液洗涤3次后加入100 μl底物缓冲液，室温置摇床上孵育10～20 min，呈现适中的黄色时上酶标仪检测各孔在波长405 nm的吸光度值(A405值)，参考波长492 nm。

六、Transwell小室检测细胞侵袭能力

用无血清DMEM培养基稀释Matrigel，取60 μl稀释的Matrigel铺在Transwell小室的隔膜上待其凝固。取上述各组细胞，用无FBS的DMEM培养基洗涤3次后重悬于无FBS的DMEM培养液，调整细胞密度为1×106/ml。Transwell上室加200 μl细胞悬液，下室加含10% FBS的DMEM培养液500 μl，小室置37℃、5% CO2孵育48 h。取出隔膜，用棉签轻轻擦去未穿膜细胞后用丙酮固定，0.1%结晶紫染色。于显微镜下取5个200倍视野，计算穿膜细胞数。每组细胞用3个小室，实验重复3次，取均值。

七、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)成管实验

人脐静脉上皮细胞株HUVECs购自ATCC，常规培养于F12K介质。应用0.75 μmol/L TW-37干预BxPC3 细胞24 h，收集培养液，离心并转移于新鲜的试管，置-20℃保存。取对数生长期HUVECs细胞 ，以5×104个细胞接种于16孔培养板，每孔加上述离心液10 μl，培养6 h。显微镜下取3～5个200倍视野，利用Imagel软件分析血管数目。

八、质粒构建及细胞转染

靶向p65的siRNA(siRNA-p65，No：sc-29410)及阴性对照siRNA(siRNA-NC)均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。委托北京辉骏生物公司将各siRNA插入pcDNA.3.1，并经测序证实质粒构建成功。插入p65 cDNA的质粒pcDNA.3.1 p65 cDNA由福建医科大学附属第一医院神经内科何忠义博士惠赠。

BxPC3 细胞常规培养并传代。取对数生长期细胞接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，加入无抗生素培养基2 ml，待细胞生长至40%～60%融合时应用Lipofectamine LTX转染试剂盒将siRNA转染细胞，按照说明书操作。

转染细胞按上述方法进行NF-κB活性及细胞凋亡的检测。

九、统计学处理

结　　果

一、不同胰腺癌细胞株Bcl-2、NF-κB表达水平

胰腺癌BxPC3细胞Bcl-2蛋白高表达，其次为HPAC细胞，AsPC1细胞表达较少，PANC1细胞表达极少； NF-κB蛋白表达量从高到低依次为PANC1、HPAC、BxPC3、AsPC1细胞(图1)。由于BxPC3和HPAC细胞Bcl-2表达量较高，因此以BxPC3和HPAC细胞作为研究对象。

图1　AsPC1(1)、BxPC3(2)、HPAC(3)、PANC1(4)细胞Bcl-2及NF-κB表达

二、TW-37干预对BxPC3、HPAC细胞增殖和凋亡的影响

TW-37干预后，BxPC3和HPAC细胞的增殖呈浓度和时间依赖性下降(P<0.05或<0.01，图2)。0.25、0.5、0.75 μmol/L TW-37干预72 h，BxPC3细胞凋亡的A405值分别为0.43±0.06、0.76±0.13、1.29±0.21，显著高于未干预细胞的0.09±0.01； HPAC细胞凋亡的A405值分别为0.38±0.07、0.64±0.12、1.07±0.18，显著高于未干预细胞的0.08±0.01，差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01)。

图2　不同浓度TW-37对BxPC3(2A)、HPAC细胞(2B)增殖的影响

三、TW-37干预对BxPC3、HPAC细胞NF-κB活性及相关蛋白表达的影响

TW-37以时间和剂量依赖性抑制BxPC3、HPAC细胞NF-κB的活性；呈浓度依赖性抑制BxPC3、HPAC细胞p65及VEGF和MMP-9蛋白的表达(P值均<0.05，图3)。

四、TW-37 干预对转染的BxPC3细胞侵袭能力的影响

对照组及0.25、0.75 μmol/L TW-37干预组的穿膜细胞数分别为(46.7±5.24)、(24.7±3.8)、(10.3±1.26)个/200倍视野，细胞的侵袭能力随TW-37浓度的增加而下降(图4)，各组间差异有统计学意义(t=4.74，P=0.001)。

五、TW-37干预对HUVECs血管形成的影响

对照组、0.75 μmol/L TW-37干预24 h组的培养上清加入HUVECs培养液中所形成的血管数分别为(39.4±4.36)、(7.84±1.25)个/200倍视野，两组间差异有统计学意义(t=5.257，P=0.001，图5)。

图3　TW-37干预后BxPC3、HPAC细胞NF-κB(3A、3B)及p65、MMP-9、VEGF(3C、3D)的表达

图4　对照组(4A)及0.25、0.75 μmol/L TW-37干预组(4B、4C)穿膜细胞(×200)

图5　对照组(5A)、0.75Tμmol/L TW-37干预组(5B)HUVECs血管形成(×200)

六、TW-37干预对转染细胞NF-κB活性及细胞凋亡的影响(表1)

单纯TW-37干预的BxPC3和HPAC细胞的NF-κB活性较对照组显著下降；转染p65 cDNA 的两株细胞的NF-κB活性较对照组显著增加；p65 cDNA转染后再用TW-37干预的两株细胞的NF-κB活性较单转染p65 cDNA组细胞下降；转染siRNA-p65的两组细胞的NF-κB活性较对照组下降，siRNA-p65转染后用TW-37干预的两组细胞的NF-κB活性又较单siRNA-p65转染组细胞进一步下降，差异均有统计学意义(P值<0.05或<0.01)。

单纯TW-37干预可诱导BxPC3和HPAC细胞凋亡，与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)；单纯p65 cDNA转染对两组细胞凋亡无明显影响，但p65 cDNA转染后再用TW-37干预的BxPC3细胞较单p65 cDNA转染增加，而HPAC细胞凋亡是减少，差异有统计学意义(P<0.05)；转染siRNA-p65的两组细胞凋亡显著增加，转染siRNA-p65后再用TW-37干预的两组细胞凋亡又较单siRNA-p65转染组细胞显著增加，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。

表1　各组BxPC3、HPAC细胞的NF-κB活性及细胞凋亡的变化

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与siRNA-p65转染组比较，cP<0.05

讨　　论

Bcl-2通路在包括胰腺癌在内的恶性肿瘤发生和发展中起重要作用[5]。激活Bcl-2可促进肿瘤细胞生长并抑制细胞凋亡，同时可提高细胞的侵袭能力[6]。Garcea等[2]报道，过度表达Bcl-2的胰腺癌患者的生存率明显下降，因此靶向Bcl-2的治疗很可能成为胰腺癌治疗的有效方式。TW-37是最近发现的小分子的Bcl-2表达抑制物，体内、外实验研究均证实它能显著抑制多种肿瘤细胞生长[7-9]。

NF-κB p65是肿瘤治疗的重要靶向基因，激活NF-κB能调节VEGF和MMP-9等多个下游基因的表达，参与调节癌细胞的迁移[10]。

此外，Bcl-2与NF-κB均参与细胞生长和凋亡的调节。抑制Bcl-2表达能抑制胰腺癌细胞内NF-κB 活性，表明NF-κB可能是Bcl-2的靶点[11]。

本研究结果显示，BxPC3、HPAC细胞有不同程度的Bcl-2基因表达，均过表达NF-κB。TW-37干预后不仅能抑制癌细胞的增殖，还能诱导癌细胞凋亡，与Azmi等[12]在前列腺癌的研究结果相一致。结果还显示，TW-37干预能抑制癌细胞NF-κB活化，且对转染siRNA-p65细胞的NF-κB活性抑制作用更显著，而细胞凋亡增加，提示TW-37可能通过抑制NF-κB活性、NF-κB p65及Bcl-2表达而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。本研究结果同时还显示， TW-37干预能抑制体外胰腺癌细胞的侵袭能力，减少 HUVECs的血管形成，提示TW-37可能是治疗胰腺癌的有效分子。

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(本文编辑：吕芳萍)

TW-37 inhibited metastasis in pancreatic cancer via regulating NF-κB signal in vitro

WuLongchao,WangLinna,LiuRuidong,WangXiaoli,TianWenxia,LiXingtao,ZhangJun.

DepartnentofGeneralSurgery,People′sHospitalofPenglai,Penglai265600,China

Correspondingauthor:ZhangJun,Email:yanxiangnj@126.com

ObjectiveTo study the effect and mechanisms of TW-37 on cell proliferation, apoptosis, invasion and angiogenesis in pancreatic cancer cells in vitro and further explore the potential mechanism. MethodsBxPC3 and HPAC cells were pretreated with TW-37 using untransfected or transfected with NF-κB p65 cDNA(p65 cDNA)or NF-κB p65 siRNA(siRNA-p65)cells as controls. Cell viability was determined by MTT assay. Cell apoptosis was assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Cell invasion and angiogenesis was detected by Transwell and endothelial tube formation assay of HUVECs. ELISA assay was used to measure the activity of NF-κB, and its target proteins of MMP-9 and VEGF were detected by western blot. ResultsTW-37 suppressed cell growth and induced apoptosis (A405:1.29±0.21vs0.09±0.01，1.07±0.18vs0.08±0.01),inhibited NF-κB activity and protein expression of NF-κB p65, VEGF and MMP-9(allP<0.05)in a dose- and time-dependent manner. The number of cells that invaded across the matrigel in the transwell chamber was (46.7±5.24) and (10.3±1.26)/×200 in BxPC3 control and 0.75

Pancreatic neoplasms;Growth;Neoplasm metastasis;Neovascularization, pathologic;TW-37

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.04.006

265600山东蓬莱，蓬莱市人民医院普外科(吴隆超)；山东省青岛疗养院检验科(王琳娜)；莱芜市人民医院检验科(刘瑞东、王晓丽、田文霞、李兴涛)；浙江省人民医院肿瘤外科(张俊)

张俊，Email: yanxiangnj@126.com

2015-07-20)