荷叶多酚体外抗氧化活性研究

孙　建，蔡为荣，谢亮亮，许惠玲，孙涛涛，田　正（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖　241000）

生物与食品科学

荷叶多酚体外抗氧化活性研究

孙建，蔡为荣∗，谢亮亮，许惠玲，孙涛涛，田正
（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000）

探究荷叶中多酚类物质的抗氧化活性.以体积分数55%乙醇恒温浸提荷叶中的多酚类物质，得到粗多酚（LP-C），经AB-8大孔树脂纯化得纯化多酚（LP-P），LP-C经大孔树脂吸附依次由30%乙醇和50%乙醇洗脱，得级分LP-30和LP-50；对上述4组样品的总还原力、羟基自由基清除率和亚硝酸盐清除率进行测定，采用HPLC-DAD法初步分析LP-30和LP-50成分.各组样品在质量浓度0.02～0.2 mg/m L范围内总还原力、清除羟基自由基活力和清除亚硝酸盐活力有良好的量效关系；经HPLC-DAD分离，级分LP-30出现3个主峰，LP-50出现7个主峰.荷叶多酚具有优良的抗氧化活性.

荷叶；多酚；清除率；抗氧化活性；HPLC-DAD

荷叶（Nelumbinis Folium），又称莲茎，古称芙蓉、菡萏、芙蕖，在我国南北均有分布，有上千年的食用历史，它是睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn）的干燥叶.荷叶苦平，归肝、脾、胃，具有清解暑热、凉血止血作用，同时具有抑制高胆固醇血症和动脉粥样硬化、抗有丝分裂、抑菌和止痉挛等作用［1］.1991年卫生部将荷叶列入第二批“既是食品又是药品”的名单中［2］.同时，荷叶中的生物活性成分种类繁多、含量丰富，这种源于自然、安全无害的植物越来越受到医学、食品、日用化工等行业的青睐.

现代研究表明，荷叶中除含有丰富的碳水化合物、脂类、蛋白质、单宁等常规化学成分外，还含有具有明显生物活性和生理功能的黄酮类、酚酸类、木脂素类等多酚类物质.Lee［3］等研究指出荷叶多酚物质具有抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导血管再生的活性，同时荷叶中多酚类物质具有较强的总还原力、清除DPPH·自由基活力和清除亚硝酸盐活性.实际上，关于荷叶多酚的抗氧化活性、多酚中有效活性成分分析等报道并不多见.研究立足于此，期望通过建立不同抗氧化体系探究荷叶多酚体外抗氧化活性强弱，继而通过HPLC技术分离分析其活性成分.

1　材料与方法

1.1材料与试剂

荷叶，购于芜湖市中山药房，干燥、粉碎后过80目筛备用；AB-8大孔树脂（天津市南开大学化工厂产品）；Folin-Ciocalteu试剂（Sigma公司）；无水碳酸钠、没食子酸、抗坏血酸、乙酸、水杨酸、无水乙醇、硫酸亚铁、双氧水、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、氯化钠、氢氧化钠、浓盐酸均为分析纯；无水对氨基苯磺酸（AR，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸萘已二胺（AR，上海晶纯试剂有限公司）；无水甲醇（色谱级），实验中试剂配制为双蒸水，HPLC分析用超纯水.

1.2仪器与设备

722型可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；H H-6数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；LGJ-10冷冻干燥器（北京松源华兴科技发展有限公司）；DHG-9023电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）；JY1002电子天平（上海良平天平厂）；RE-52A旋转蒸发器（上海青浦沪西仪器厂）；TGL-16C离心机（金坛市杰瑞尔）；DZX-6050B真空泵（上海福玛实验设备有限公司）；Waters1525高效液相色谱仪（配备1525二元泵，DAD2998检测器，2707自动进样器，Breeze2工作站；美国Waters公司）.

1.3方法

（1）没食子酸标准曲线的绘制.参考Maria［4］等方法，并做少许改动.准确称取0.25 g没食子酸标准品用50%乙醇溶液定容至50 m L容量瓶，再分别配制0.05 mg/m L、0.1 mg/m L、0.15 mg/m L、0.2 mg/m L、0.25 mg/m L、0.3 mg/m L、0.5 mg/m L标准溶液.分别从上述标液中各取0.1 m L于10 m L刻度试管中，加适量蒸馏水混合后，加入0.5 m L稀释10倍的Folin-ciocalteu试剂，混合反应5 min后加入2 m L质量分数15%的Na2CO3溶液，混合，定容，静置2 h后在765 nm处测吸光度.

（2）荷叶多酚的提取和含量测定.按料液比1∶20、温度60℃、55%乙醇（V/V）条件下恒温浸提90 min，将所得浸出物抽滤，滤渣按同样条件再次浸提，抽滤，滤液混合.混合液于旋转蒸发器中，38℃条件下真空除去乙醇，得到浓缩液，3 500 r/min下离心除去沉淀，得荷叶多酚粗提取液（LP-C）.适当稀释后计算待测液多酚质量浓度C，按下式计算荷叶多酚提取率，以没食子酸当量（Gallic Acid Equivalent，GAE）表示，单位为mg GAE/g荷叶干粉.荷叶干粉提取率为：

式中，C为待测样品液质量浓度；V为提取液体积；N为浓缩液稀释倍数；m为称量的荷叶粉质量.

（3）粗多酚的纯化.参考朱静对大孔树脂的处理方法［5］对AB-8大孔树脂进行预处理.将所得LP-C分为两份，分别上柱，一份直接用70%（V/V）乙醇溶液进行洗脱，得到样品LP-P；另一份依次用30%（V/V）、50%（V/V）和70%（V/V）乙醇溶液进行梯度洗脱，得到级分LP-30、LP-50和LP-70.将所得洗脱液旋蒸除去溶剂，冷冻干燥.多酚纯度计算：称取冻干后质量为m2的样品，溶解，测定其多酚总量m1，计算其纯度为：

（4）抗氧化活性研究.准确称取各组样品（或Vc）50 mg溶解于50%乙醇中，转移至50 m L容量瓶，定容得到质量浓度1 mg/m L样品原液.随后配制各种不同质量浓度样品待测液，以Vc为阳性对照，考察各组多酚样品的总还原力，清除羟基自由基活力和清除亚硝酸盐活力.

①总还原力的测定.参考Liu［6］等的方法，实验用水为双蒸水，铁氰化钾溶液须现配现用.②清除羟基自由基的测定.参考颜军［7］等的方法，其清除率公式为：

式中，A0为空白对照液吸光值；A1为加入样品后反应体系吸光值；A2为样品的本底吸光值.

③清除亚硝酸盐的测定.参考宋茹［8］等的方法，其清除率公式为：

式中，A0为以样品溶剂代替样品溶液测得的吸光值；A1为加入样品液后实验组吸光值；A2为以蒸馏水代替亚硝酸钠溶液测得吸光值，样品的本底吸收.

（5）HPLC-DAD分析.色谱分析主要考察了LP-30部分和LP-50部分可能含有的活性成分.DAD检测器启用3D波长扫描模式，波长扫描范围210～400 nm.柱子为沃特斯Sunfire反相C18柱（4.6×150 mm，5μm），配备柱温箱保持分离条件下恒温30℃.进样体积为20μL，流速0.8 m L/min.流动相：A相，无水甲醇；B相，0.5%乙酸水溶液（v/v）.LP-30部分与LP-50部分的活性成分种类、性质不同，故采用两种不同梯度洗脱程序.对级分LP-30：0～10 min，5%～10%A相；10～30 min，10%～50%A相.对级分LP-50：0～8 min，30%～30%A相；8～18 min，30%～55%A相；18～40 min，55%～65%A相.

2　结果与分析

2.1各组样品多酚的含量

应用软件Origin 8.0进行线性拟合，得到没食子酸标准曲线的回归方程Y=0.889 7X+0.009 3，在0.05～0.5 mg/m L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数达到0.997 6，标准曲线如图1所示.

将多酚粗提液稀释4倍，计算荷叶多酚提取率为48.50 mg GAE/g荷叶干粉，这与赵晓云［9］等对荷叶多酚的提取率相当.粗多酚（LP-C）经过大孔树脂纯化后得到纯化多酚（LP-P），其纯度由24.24%提高到52.85%，显示出大孔树脂对荷叶粗多酚优良的纯化效果，这与李均［10］等对中华补血草根多酚的纯化效果相当.另一部分粗多酚上大孔树脂经不同质量浓度乙醇溶液梯度洗脱后，级分LP-30得率为总吸附量的59.63%，级分LP-50得率为总吸附量的21.2%，级分LP-70得率为总吸附量的4.87%.表明级分LP-30多酚含量最丰富，LP-50含量次之，LP-70含量最低.经计算，荷叶多酚在大孔树脂上总解吸率为86.35%.

2.2抗氧化实验结果

（1）各组样品的总还原力大小.还原力强的样品产生的电子能将反应体系中的铁氰化钾（K3［Fe（CN）6］）的三价铁还原成二价铁（亚铁氰化钾），二价铁进一步和三氯化铁反应，生成在700 nm波长下有最大吸光值的普鲁士蓝（Fe4［Fe（CN）6］3）［11］.依照同样的反应机理，孟庆焕［12］测定了牡丹种皮黄酮的总还原力，反应体系吸光值越大表示样品的还原力越强，还原力与样品抗氧化能力呈正相关.不同质量浓度下4组样品和Vc在700 nm波长处的吸光值变化如图2所示.由图2可以看出，各组样品随着样品质量浓度的增大，A700吸光值不断增大，还原力不断增强.整体来看，Vc的总还原力最强，在0.08 mg/m L质量浓度时，吸光值达到0.533，而LP-P为0.331，LP-C仅为0.12，总还原力大小顺序为：LP-P＞LP-30＞LP-50＞LP-C.在质量浓度达到0.1 mg/m L时，LP-P与LP-C在700 nm处吸光度分别为0.461与0.159.可见，荷叶多酚经AB-8大孔树脂纯化后，总还原力有显著增强.级分LP-30总还原力比LP-50强，质量浓度达到0.2 mg/m L时，两者的吸光值达到0.61和0.342，这可能与两样品中多酚的含量、种类和性质有关.

图1　没食子酸测定总多酚标准曲线

图2　不同质量浓度Vc和4组样品在700 nm波长处吸光值

（2）各组样品对羟基自由基的清除能力.生物体内，有害的羟基自由基会导致细胞膜系统氧化并与生物大分子反应，造成细胞损伤乃至死亡［13］.样品和Vc在不同质量浓度下对羟基自由基的清除率如图3所示.由图3可以看出，Vc对羟基自由基的清除率最高，质量浓度为0.04 mg/m L时，清除率即达到50.15%，而LP-C在质量浓度达到0.2 mg/m L时，清除率仅有47.44%，但级分LP-30与LP-50清除率分别达到71.12%和63.73%.经计算，LP-30和LP-50的IC50分别为0.059 3 mg/m L和0.083 1 mg/m L，可见，级分LP-30清除率较高.整体来看，各组样品在0.02～0.2 mg/m L质量浓度范围内，对自由基的清除率均随质量浓度的增大不断增强，总清除活力大小顺序为：Vc＞LP-30＞LP-50＞LP-P＞LP-C.

（3）各组样品对亚硝酸盐的清除能力.亚硝酸盐能够与仲胺合成亚硝胺，而亚硝胺是一类明确的化学致癌物，它能够引起人体和动物肝脏等多种器官的恶性肿瘤［14］.一次大剂量摄入亚硝酸盐会导致机体发生急性亚硝酸盐中毒，出现高铁血红蛋白症；长期低剂量摄入亚硝酸盐则会导致慢性亚硝酸盐中毒.可见，有效清除亚硝酸盐对机体健康有重要意义.不同质量浓度Vc和4组样品对亚硝酸盐的清除率影响如图4所示.由图4可以看出，Vc清除亚硝酸盐活力均较其他组强，在质量浓度为0.1 mg/m L时，其清除率即达到92.57%，质量浓度0.2 mg/ml时，清除率达到99.24%，这与库尔班［15］对Vc的实验结果一致.样品组中，LP-50的IC50（0.055 2 mg/m L）比LP-30的IC50（0.059 7 mg/m L）略低，在质量浓度0.02～0.1 mg/m L范围内，两组的清除率分别从19.31%到87.64%和15.58%到83.63%，并且都显示一定量效关系.值得注意的是，LP-C部分清除率大于LP-P，甚至在样品质量浓度0.02 mg/m L时，其清除率（22.56%）大于Vc清除率（16.18%）.类似的，也有研究指出山竹壳粗多酚［14］的清除活力强于对照品Vc.整体来看，4组样品对亚硝酸盐均有显著的清除活力，在质量浓度达到0.2 mg/m L时，其清除率都达到97%以上.

图3　不同质量浓度Vc和4组样品对羟基自由基的清除率

图4　同质量浓度Vc和4组样品对亚硝酸盐的清除率

2.3HPLC-DAD分析

样品经DAD检测器在线紫外波长扫描（210～400 nm），结合田娜［16］和Ye［17］等研究所用波长，选择360 nm为走样检测波长.两级分和标准品的色谱分离图谱如图5、图6所示.由图5、图6可以看出，在选定的色谱柱、流速、洗脱梯度等色谱条件下，级分LP-30各组分分离度较好，LP-50部分峰6与峰7间的分离度R达到1.30＞1，表明两峰的分离程度大于98%.总体来看，选定的色谱条件对两组样品中有效成分均有较为理想的分离，有利于后续研究.

图5　级分LP-30及标准品芦丁的HPLC分离图谱

图6　级分LP-50及标准品金丝桃苷和槲皮素的HPLC分离图谱

大多数黄酮类化合物在紫外波长扫描下呈现两个特征吸收峰，一个在波长300～400 nm范围内，称为带Ⅰ，由B-环肉桂酰系统影响；另一个在波长240～280 nm范围内，称为带Ⅱ，由A-环苯酰系统影响.级分LP-30峰2和标准品芦丁，LP-50峰5和标准品槲皮素的UV谱图如图7所示.由图7可以看出，级分LP-30中，峰2保留时间（32.742 min）与芦丁保留时间（32.693 min）很接近，调出峰2和芦丁的UV谱图（见图7a）发现，峰2中出现两吸收峰（255.6，354.5）分别介于300～400 nm范围和240～280 nm范围，与芦丁类似，表明峰2成分可能含有肉桂酰系统和苯酰基.级分LP-50中，槲皮素出峰时间（23.970 min）与峰5（24.147 min）相近，调出峰5的UV谱图（见图7b）发现，峰5的两吸收峰（254.4，362.8）同样介于300～400 nm和240～280 nm范围内，与槲皮素类似，表明峰5成分中可能也含有肉桂酰系统和苯酰基.

图7　级分LP-30峰2和标准品芦丁，LP-50峰5和标准品槲皮素的UV谱图

3　结论

荷叶多酚具有优良的抗氧化活性.总还原力测定结果表明，总还原力大小与样品质量浓度有明显的质量浓度依赖效应，4组样品总还原力大小顺序为：LP-P＞LP-30＞LP-50＞LP-C；在Fenton体系中，级分LP-30表现出最高的清除·OH能力，其IC50为0.059 3 mg/m L，比LP-50（0.083 1 mg/m L）略低，质量浓度达到0.2 mg/m L时，清除率可达到71.12%；在清除亚硝酸盐实验中，各组样品均表现出较高的清除率，质量浓度为0.1 mg/m L时，级分LP-50与LP-30的清除率随即达到87.64%和83.63%.质量浓度达到0.2 mg/m L时，各组样品的清除率均可达到97%以上；HPLC-DAD分离结果表明，选定的色谱条件对LP-30和LP-50中活性组分分离较好，级分LP-30有3个主峰，LP-50有7个主峰.

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Study on in Vitro Antioxidant Activity of Polyphenols Extracted from Lotus Leaves

SUN Jian，CAI Wei-rong∗，XIE Liang-liang，XU Hui-ling，SUN Tao-tao，TIAN Zheng
（College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

The researh aimed to investigate the antioxidant activity of polyphenols from lotus leaves.LP-C was the polyphenols extracted with 55%ethyl alcohol at a constant temperature and LP-P was the total polyphenols purified by AB-8 macroporous resins.LP-30 and LP-50 were obtained by gradiently eluting polyphenols absorbed on macroporous resins.Total reducing power，hydroxy radical scavenging rate and nitrite sacvenging rate were measured for the above four samples.In additon，the HPLC-DAD method was used to analyze constituents of LP-30 and LP-50 preliminarily.The four samples exhibited strong total reducing power，hydroxy radical scavenging activity and nitrite scavenging activity，which was obviously related to the concentration（0.02～0.2 mg/m L）.Three peaks in LP-30 and five peaks in LP-50 were determined by HPLC-DAD separation.Polyphenols in lotus leaves had excellent in vitro antioxidant activity.

lotus leaves；polyphenols；scavenging rate；antioxidant activity；HPLC-DAD

TS201.2

A

1672-2477（2016）04-0001-06

2016-01-10

安徽省自然科学基金资助项目（1408085 MC52）

孙建（1990-），男，河南信阳人，硕士研究生.

蔡为荣（1963-），男，安徽芜湖人，教授，硕导.