牛源犬新孢子虫对BABL/c孕鼠胎盘激素和细胞因子调节功能的影响

贾立军，马　莉，2，张守发，李男礼，赵　鹏，李积旭

(1.延边大学农学院动物医学系，延吉 133000；2.辽宁省凌海市动物疫病预防控制中心，凌海 121200)



牛源犬新孢子虫对BABL/c孕鼠胎盘激素和细胞因子调节功能的影响

贾立军1，马莉1，2，张守发1，李男礼1，赵鹏1，李积旭1

(1.延边大学农学院动物医学系，延吉 133000；2.辽宁省凌海市动物疫病预防控制中心，凌海 121200)

旨在探讨牛源犬新孢子虫对孕鼠胎盘激素和细胞因子调节功能的影响。以牛源犬新孢子虫BABL/c孕鼠感染模型为研究对象，同时设置正常对照组孕鼠，在攻虫第12、14、16、18天分批处死孕鼠，采集孕鼠血清，制备孕鼠胎盘细胞悬液，采用ELISA方法对牛源犬新孢子虫感染孕鼠血清中CRH、CG、PRL及E3等胎盘激素水平，以及孕鼠胎盘细胞悬液中IFN-γ、IL-4及TGF-β等细胞因子水平进行检测。结果显示，与正常对照组孕鼠比较，牛源犬新孢子虫感染孕鼠模型随攻虫时间的增加，在孕鼠血清中，CRH水平在第12天时显著升高(P<0.05)，在第18天时显著下降(P<0.01)；CG水平在第12天时显著下降(P<0.01)，在第16天时显著升高(P<0.05)；PRL水平在第18天时显著下降(P<0.05)；E3水平在第12天时显著升高(P<0.05)，第16天时显著下降(P<0.05)。在孕鼠胎盘细胞悬液中，IFN-γ水平在第18天时显著升高(P<0.05)；IL-4水平在第12天时显著升高(P<0.05)；TGF-β水平在第12天时显著升高(P<0.05)。结果表明牛源犬新孢子虫感染导致孕鼠胎盘激素和细胞因子的调节功能失衡，严重影响胎盘血流、胎盘物质转运及胎儿生长发育，将导致不良妊娠的发生。

犬新孢子虫；BABL/c孕鼠；胎盘；激素；细胞因子

犬新孢子虫(Neosporacaninum)是寄生于牛、羊、犬等多种哺乳动物细胞内的一种原虫。犬新孢子虫主要引起母畜流产、死胎或新生儿运动障碍和神经系统疾病[1-3]。新孢子虫病可垂直传播，对牛的危害极为严重，已成为危害养牛业健康发展的主要因素之一[4-7]。M.P.Reichel等统计显示，全球每年因犬新孢子虫感染或流产所造成的经济损失最高达23.8亿美元[8]。目前，国内外对犬新孢子虫的研究虽然取得了一定进展，但犬新孢子虫引起孕畜流产、死胎的致病作用还不明确，尤其是犬新孢子虫对胎盘的损伤作用尚不清楚。胎盘是母体妊娠期的多功能器官，在母体与胎儿之间起着非常重要的作用，承担着母胎之间的气体交换、营养供应、新陈代谢及疾病防御等功能[9-10]。胎盘分泌的激素和细胞因子在妊娠期中的作用极其重要。胎盘分泌多种激素类物质，以此维持母体的正常妊娠、胎盘和胎儿生长发育及母胎之间物质转运等[11-13]；胎盘分泌的细胞因子一方面可以促进胎盘生长，另一方面又可以抑制胎盘生长[14]。胎盘功能失调必将影响胎儿的正常发育和健康生长。因此，作者以牛源犬新孢子虫孕鼠感染模型为研究对象，对影响胎盘物质转运、胎盘血流及胎儿生长发育的激素和细胞因子等水平进行检测，以期为犬新孢子虫致病作用的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1主要试剂和虫株

组织DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA Marker、ExTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司；CRH、CG、PRL、E3等胎盘激素检测试剂盒，IFN-γ、IL-4、TGF-β等细胞因子检测试剂盒均购自美国ADI公司；其他常规试剂为进口或国产分析纯产品。牛源犬新孢子虫延边株由延边大学预防兽医学实验室分离、保存[15]；Vero细胞由延边大学预防兽医学实验室培养、保存。

1.2实验动物分组与处理

BALB/c小鼠购自延边大学实验动物中心，随机选取8周龄、雌性、体重20 g左右BALB/c小鼠80只。分为牛源犬新孢子虫孕鼠感染模型组，同时设立正常孕鼠对照组，每组40只。于攻虫第12、14、16、18天分批处死孕鼠，每批10只，采集孕鼠血液，分离血清；同时分离胎鼠胎盘，制备胎盘组织细胞悬液。

1.3孕鼠血清中胎盘激素水平检测

按不同时间将模型组和对照组收集的孕鼠血清样本，分别按照CRH、CG、PRL及E3试剂盒说明进行检测。根据标准品的浓度及对应的OD值，绘制标准曲线的直线回归方程，再根据检测样品的OD值计算对应样品的浓度。

1.4孕鼠胎盘细胞悬液中细胞因子水平检测

按不同天数将模型组和对照组制备的孕鼠胎盘细胞悬液，分别按照IFN-γ、IL-4及TGF-β试剂盒说明进行检测。根据标准品的浓度及对应的OD值，绘制标准曲线的直线回归方程，再根据检测样品的OD值计算对应样品的浓度。

1.5数据统计

2　结　果

2.1牛源犬新孢子虫孕鼠感染模型胎盘中虫体DNA检测

BALB/c小鼠接种牛源犬新孢子虫速殖子后，孕鼠先后出现被毛逆立、共济失调等临床症状，接种虫体第12、14、16、18天时，在胎盘组织中均检测到了犬新孢子虫Nc5基因684bp目的条带(图1)，经测序与GenBank中(AF061249)相似性为100%。经对染虫孕鼠的整体评估，确定孕鼠感染模型符合试验标准。

M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1.Nc5基因阳性对照；2.接种虫体第12天；3.接种虫体第14天；4.接种虫体第16天；5.接种虫体第18天；6.PCR水对照M.DL2000 DNA molecular weight marker；1.Positive control of Nc5 gene；2.The 12th day after infection；3.The 14th day after infection；4.The 16th day after infection；5.The 18th day after infection；6.Negative control图1　接种虫体不同天数孕鼠胎盘Nc5基因检测结果Fig.1　Nc5 gene was measured in placenta of pregnant mice after indicated days after infection

2.2影响胎盘血流指标CRH的检测

影响胎盘血流指标的CRH检测结果表明，随孕期或攻虫时间的增加，对照组孕鼠CRH浓度持续上调，而模型组孕鼠CRH浓度持续下调，二者变化方向相反。模型组与对照组比较，在第12天时，孕鼠血清中CRH水平差异显著(P<0.05)，在第18天时CRH水平差异极显著(P<0.01)(表1)。

2.3影响胎盘物质转运指标CG、PRL、E3的检测

影响胎盘物质转运指标CG检测结果表明，随孕期或攻虫时间的增加，对照组孕鼠CG浓度先下调再上调，而模型组孕鼠CG浓度持续上调。模型组与对照组比较，在第12天时孕鼠血清中CG水平差异极显著(P<0.01)；在第16天时孕鼠血清中CG水平差异显著(P<0.05)(表2)。

ng·mL-1

与对照组相比较，*.表示差异显著(P<0.05)；**.差异极显著(P<0.01)。下表同

Compared with control，*.Significant difference(P<0.05)；**.Significant difference(P<0.01).The same as below

ng·mL-1

影响胎盘物质转运指标PRL检测结果表明，随孕期或攻虫时间的增加，对照组和模型组孕鼠PRL水平均出现先下调后上调现象，但模型组PRL整体水平较对照组低。模型组与对照组比较，在第18天时孕鼠血清中PRL水平差异显著(P<0.05)(表3)。

ng·mL-1

影响胎盘物质转运指标E3检测结果表明，随孕期或攻虫时间的增加，对照组和模型组孕鼠E3水平均呈现上下波动变化，但模型组孕鼠E3水平波动变化明显。模型组与对照组比较，在第12、16天时孕鼠血清中E3水平差异显著(P<0.05)(表4)。

pg·dL-1

2.4孕鼠胎盘细胞悬液中IFN-γ浓度变化

通过对IFN-γ检测结果显示，随孕期或攻虫时间的增加，对照组和模型组孕鼠IFN-γ水平均出现先上调后下调现象，但模型组孕鼠IFN-γ整体水平高于对照组。模型组与对照组比较，在第18天时孕鼠胎盘细胞悬液中IFN-γ水平差异显著(P<0.05)(表5)。

ng·L-1

2.5孕鼠胎盘细胞悬液中IL-4浓度变化

通过对IL-4检测结果显示，随孕期或攻虫时间的增加，对照组孕鼠IL-4水平处于平衡状态，而模型组孕鼠IL-4浓度先下调后上调，且模型组孕鼠IL-4整体水平高于对照组。模型组与对照组比较，在第12天时孕鼠胎盘细胞悬液中IL-4水平差异显著(P<0.05)(表6)。

pg·mL-1

2.6孕鼠胎盘细胞悬液中TGF-β浓度变化

通过对TGF-β检测结果显示，随孕期或攻虫时间的增加，对照组孕鼠TGF-β水平先上调后下调，而模型组孕鼠TGF-β水平持续上调。模型组与对照组比较，在第12天时孕鼠胎盘细胞悬液中TGF-β水平差异显著(P<0.05)(表7)。

pg·mL-1

3　讨　论

胎盘是妊娠期一个暂时的多功能器官，在妊娠期间胎盘分泌激素的作用极为重要。CRH、CG、PRL、E3等均为胎盘分泌的激素，胎盘激素的合成与释放，直接影响着母体妊娠、胎儿生长发育、母胎之间的物质转运、胎盘细胞的增殖分化等。促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)是肽类激素，妊娠期间胎盘合成CRH可作用于妊娠期子宫，产生重要的旁分泌和自分泌功能，有利于妊娠期的免疫耐受和保护胚泡植入。CRH重要的生理功能是扩张胎盘血管，对保障母体与胎儿之间的血流灌注、胎儿新陈代谢、缓解胎儿缺氧应激等方面具有生理性代偿的保护作用。本试验结果显示，随攻虫时间的增加模型组孕鼠CRH浓度持续下调，与对照组变化方向相反，在第18天时CRH水平与对照组差异极显著(P<0.01)。可能是由于牛源犬新孢子虫入侵胎盘细胞后，随着虫体入侵时间的延长，造成胎盘细胞损伤愈加严重，提示胎儿在此阶段可能出现缺血缺氧状态，期间可能损伤血管细胞和胎盘细胞。

绒毛膜促性腺激素(CG)是由胎盘滋养层细胞分泌的糖蛋白类激素，妊娠期间在血浆和尿液中含量较高；CG可调节类前列腺素和固醇激素的合成，CG还具有免疫抑制作用；血浆中CG含量变化可预测和诊断妊娠高血压综合征、流产、胎儿缺氧、胎儿宫内发育迟缓等多种妊娠不良结局[16-17]。胎盘催乳素(PRL)是由胎盘合体滋养细胞合成释放的蛋白激素，PRL可促进胎盘细胞的分化增殖、胎儿的营养物质代谢和能量代谢等；若胎盘催乳素分泌异常，可导致不良妊娠。妊娠期血清中雌三醇(E3)主要由胎盘合成，妊娠期间，雌三醇在母体血浆中的含量变化能反应胎儿与胎盘功能，雌三醇含量减少，可导致胎儿畸形或胎儿宫内发育迟缓等症状。

CG、PRL、E3均是影响胎盘物质转运功能的重要激素。本试验中模型组孕鼠随攻虫时间的增加，与对照组比较，模型组孕鼠CG浓度持续上调，在第12天时CG水平差异极显著(P<0.01)，在第16天时CG水平差异显著(P<0.05)，提示CG浓度的持续上调，极可能导致孕鼠发生流产、死胎、胎儿宫内发育迟缓现象的发生。模型组孕鼠PRL水平先下调后上调，与对照组比较，整体水平显著降低，在第18天时PRL水平差异显著(P<0.05)，提示虫体入侵造成胎盘病理性损伤，导致胎盘功能减退，严重影响胎儿的能量代谢和对营养物质的摄取，可能导致胎儿在宫内出现营养不良或发育迟缓等现象。模型组孕鼠E3水平波动变化明显，与对照组比较，在第12、16天时E3水平差异显著(P<0.05)，提示产前E3含量显著变化，可导致胎儿畸形或胎儿宫内发育迟缓等现象。

细胞因子与妊娠之间有着密切的关系，正常妊娠情况下，胎盘分泌IFN-γ、IL-4及TGF-β等多种细胞因子。A.Rosbottom等研究表明，细胞因子在犬新孢子虫感染过程中具有一定作用，可能与胎儿的死亡有关[11]；I.C.López-Pérez等研究表明，在犬新孢子虫感染的孕鼠脾中IFN-γ、IL-10的增加和孕鼠胎盘中IL-4的表达，可能提高犬新孢子虫经胎盘传播给胎儿的概率[18]；S.Almería等研究证实，在犬新孢子虫感染母畜的胎盘组织中，细胞因子IFN-γ表达上调和TGF-β的表达下调有利于胎儿存活，表明细胞因子对犬新孢子虫的胎盘传播具有重要作用[19]。本试验中模型组孕鼠随攻虫时间的增加，在孕鼠胎盘细胞悬液中，IFN-γ和IL-4整体水平均显著高于对照组，这可能是导致犬新孢子虫垂直传播的主要因素；而模型组TGF-β水平持续上调，将不利于胎儿存活，可能是导致流产、死胎的重要因素。

4　结　论

牛源犬新孢子虫感染孕鼠后，胎盘激素CRH水平的持续下调，将影响母体与胎儿之间的血流灌注，导致胎儿出现缺血缺氧状态；胎盘激素CG、PRL及E3调解功能失衡，是胎盘组织病理损伤和滋养层细胞凋亡增加的病理生理基础，将导致不良妊娠的发生；细胞因子IFN-γ、IL-4及TGF-β水平上调，将提高虫体垂直传播的概率，严重影响胎儿正常生长发育。

[1]DUBEY J P，CARPENTER J L，SPEER C A，et al.Newly recognized falal protozoan disease of dogs[J].JAmVetMedAssoc，1988，192(9)：1269-1285.

[2]KLAUCK V，MACHADO G，PAZINATO R，et al.Relation between Neospora caninum and abortion in dairy cows：Risk factors and pathogenesis of disease[J].MicrobPathog，2016，92：46-49.

[3]WILSON D J，ORSEL K，WADDINGTON J，et al.Neospora caninum is the leading cause of bovine fetal loss in British Columbia，Canada[J].VetParasitol，2016，218：46-51.

[4]贾立军，于龙政，张守发.表达牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析[J].畜牧兽医学报，2012，43(3)：446-452.

JIA L J，YU L Z，ZHANG S F.Construction of a recombinant adenovirus expressing NcSRS2 protein of bovineNeosporacaninumand immunogenicity analysis of the protein[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2012，43(3)：446-452.(in Chinese)

[5]邹世颖，何倩妮，王小蕾，等.我国北方六省市牛新孢子虫病血清学调查[J].中国兽医杂志，2012，48(2)：54-55.

ZOU S Y，HE Q N，WANG X L，et al.Serological investigation of Neosporosis in six provinces，northern China[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine，2012，48(2)：54-55.(in Chinese)

[6]李坤，高建峰，韩照清，等.西藏部分地区黄牛新孢子虫流行病学调查[J].中国奶牛，2014(14)：57-58.

LI K，GAO J F，HAN Z Q，et al.Survey on seroprevalence of neospora caninum infection in cattle of Tibet[J].ChinaDairyCattle，2014(14)：57-58.(in Chinese)

[7]HAO P，YANG N，CUI X，et al.First isolation of Neospora caninum from blood of a naturally infected adult dairy cow in Beijing，China[J].JParasitol，2014，100(6)：812-816.

[8]REICHEL M P，ALEJANDRA AYANEGUI-ALCéRRECA M，GONDIM L F，et al.What is the global economic impact of Neospora caninum in cattle-The billion dollar question[J].IntJParasitol，2013，43(2)：133-142.

[9]饶华祥，侯玉英.刚地弓形虫感染致胎盘损伤作用的研究进展[J].中国病原生物学杂志，2008，3(4)：318-320.

RAO H X，HOU Y Y.The research progress on lesion in placenta induced byToxoplasmagondiiinfection[J].JournalofPathogenBiology，2008，3(4)：318-320.(in Chinese)

[10]赵晋英，侯玉英，李艳伟，等.孕中期弓形虫感染对孕鼠血清孕酮及雌三醇含量的影响[J].中国病原生物学杂志，2008，3(6)：425-427.

ZHAO J Y，HOU Y Y，LI Y W，et al.The decrease of the progesterone and estriol of pregnant mice infected withToxoplasmagondii[J].JournalofPathogenBiology，2008，3(6)：425-427.(in Chinese)

[11]ROSBOTTOM A，GIBNEY E H，GUY C S，et al.Upregulation of cytokines is detected in the placentas of cattle infected with Neospora caninum and is more marked early in gestation when fetal death is observed[J].InfectImmun，2008，76(6)：2352-2361.

[12]岳慧萍，饶华祥，侯玉英，等.弓形虫感染对妊娠中期孕鼠血清中胎盘激素含量的影响[J].中国病原生物学杂志，2009，4(10)：763-766.

YUE H P，RAO H X，HOU Y Y，et al.Effects of serum of placental hormones in BALB/c mice infected withToxoplasmagondiiduring the second trimester[J].JournalofPathogenBiology，2009，4(10)：763-766.(in Chinese)

[13]张慧芳，侯玉英，岳慧萍，等.孕鼠弓形虫感染对胎盘激素水平的影响[J].中国病原生物学杂志，2012，7(1)：26-29.

ZHANG H F，HOU Y Y，YUE H P， et al.Effects ofToxoplasmagondiiinfection on placenta hormones in pregnant BALB/c mice[J].JournalofPathogenBiology，2012，7(1)：26-29.(in Chinese)

[14]郭保平，徐明龙，胡进，等.DHEA诱导雌性大鼠PCOS模型早期性器官及其相关激素变化的研究[J].畜牧兽医学报，2015，46(8)：1348-1355.

GUO B P，XU M L，HU J，et al.Studies on changes of sexual organs and their related hormones during the early phase in dehydroepiandrosterone-induced female rat polycystic ovarian syndrome model[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2015，46(8)：1348-1355.(in Chinese)

[15]JIA L J，ZHANG S F，LIU M M，et al.Isolation，identification，and pathogenicity of neospora caninum China Yanbian strain[J].IranJParasitol，2014，9(3)：394-401.

[16]ESTERMAN A，FINLAY T H，DANCIS J.The effect of hypoxia on term trophoblast：hormone synthesis and release[J].Placenta，1996，17(4)：217-222.

[17]ALSAT E，WYPLOSZ P，MALASSINÉ A，et al.Hypoxia impairs cell fusion and differentiation process in human cytotrophoblast，invitro[J].JCellPhysiol，1996，168(2)：346-353.

(编辑白永平)

Imbalance of Placental Hormones and Cytokines Regulation in Pregnant BALB/c Mice Infected by BovineNeosporacaninum

JIA Li-jun1，MA Li1，2，ZHANG Shou-fa1，LI Nan-li1，ZHAO Peng1，LI Ji-xu1

(1.DepartmentofVeterinaryMedicine，AgriculturecollegeofYanbianUniversity，Yanji133002，China；2.Animaldiseasepreventionandcontrolcenter，Linghai121200，China)

To invest the affection on regulating function of pregnant BALB/c mice placental hormones and cytokines caused by bovineNeosporacaninum，in present study，we established the pregnant BALB/c mice model infected with bovineNeosporacaninum，and pregnant BALB/c mice non-infected as negative control group.For collecting serum，mice of each group were sacrificed on the 12th，14th，16th，18th day after infection.The placental hormones CRH，CG，PRL and E3 in serum，and cytokines IFN-γ，IL-4 and TGF-β in placental cell suspension from pregnant mice were detected using ELISA method.Compared with control group，the results showed that CRH levels in pregnant BALB/c mice serum was significantly increased (P<0.05) on the 12th day and decreased significantly (P<0.01) on the 18th day after infection；while GC levels was decreased significantly (P<0.01) on the 12th day and increased significantly (P<0.05) on the 16th day；PRL levels was decreased significantly (P<0.05) on the 18th day；E3 levels was significantly increased (P<0.05) on the 12th day and decreased significantly (P<0.05) on the 16th day.At the same time，IFN-γ levels in pregnant BALB/c mice placental cell suspension was increased significantly (P<0.05) on the 18th day；while IL-4 and TGF-β levels were both increased significantly (P<0.05) on the 12th day.These results indicated that infection by bovineNeosporacaninumin pregnant mice would lead to imbalance of placental hormones and cytokines regulative function and seriously affect placental blood flow，placenta mass transport，fetal growth and development.All these will lead to adverse pregnancy outcomes.

bovineNeosporacaninum；pregnant BALB/c mice；placenta；hormone；cytokines

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.021

2016-03-25

贾立军(1978-)，男，吉林镇赉人，副教授，博士，主要从事分子免疫学研究，E-mail：ljjia@ybu.edu.cn

S852.723

A

0366-6964(2016)08-1689-07

资金项目：国家自然科学基金(31160501；31360605)；吉林省重点科技攻关项目(20140204078NY)；吉林省教育厅重点项目(吉教科合字[2015]第 1 号)；吉林省自然科学基金(20160101201JC)