中国部分地区鸭、鹅携带四种病毒状况的调查与分析

刘　洋，王传彬，霍斯琪，翟新验，辛盛鹏，刘玉良，韩　雪，张　倩，杨卫铮，顾小雪

(中国动物疫病预防控制中心，北京 102618)



中国部分地区鸭、鹅携带四种病毒状况的调查与分析

刘洋，王传彬，霍斯琪，翟新验，辛盛鹏，刘玉良，韩雪，张倩，杨卫铮，顾小雪*

(中国动物疫病预防控制中心，北京 102618)

为了解中国部分地区鸭、鹅的病毒携带情况，作者于2014年11月，从安徽、浙江、福建、广东、广西5省的多个表观健康鸭、鹅群中采集样品1 931份，采用荧光定量PCR对鸭瘟病毒(DPV)、鸭甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)、小鹅瘟病毒(GPV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)进行检测。结果显示，DTMUV阳性率为1.2%，DPV阳性率为0.3%；其余两种病毒均未检出。结果表明，临床表观健康的鸭、鹅可携带鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒，而且，序列分析结果显示，所携带的毒株与临床分离的相应致病性毒株相似性较高，提示在水禽疫病传播过程中，表观健康但带毒的动物可能成为疫病传播的风险点。

鸭瘟病毒；鸭甲型肝炎病毒1型；小鹅瘟病毒；鸭坦布苏病毒；流行病学调查

中国是世界上水禽饲养最多的国家，但由于养殖技术落后，饲养数量和饲养密度的不断增加以及各省市间频繁的活禽调运，导致水禽疫病愈发严重，出现“老病未除(如20世纪50年代即出现的鸭瘟、鸭病毒性肝炎以及小鹅瘟)、新病又起(如2010年以来我国大范围暴发的鸭坦布苏病毒病)”的复杂局面。另一方面，水禽疫病的相关研究大多集中于对发病动物或群体的零星报道，而对水禽整体疫病的流行情况不甚了解，尤其对健康鸭群或鹅群中相关疫病的感染情况更鲜有报道。因此，为初步了解我国水禽群体中相关疫病的隐性感染状况，作者在我国水禽养殖主要产区的多个省市，分别从水禽养殖的不同环节中采集表观健康鸭鹅的泄殖腔拭子、组织及环境样本，进行鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒1型、小鹅瘟病毒、鸭坦布苏病毒的分子流行病学调查，以期为进一步制定全面的监测计划、采取检疫措施和科学防控水禽疫病提供参考。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器

5×MagMAXTM-96 Viral Isolation Kit和AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit购自ABI公司。GoTaq Probe qPCR Master Mix购自Promega公司。pEASY-T3 Cloning Kit购自全式金公司。7500实时荧光定量PCR系统购自ABI公司，TissueLyser Ⅱ组织研磨仪购自QIAGEN公司。

1.2样品采集和信息调查

选择我国水禽养殖主产区的安徽、浙江、福建、广东和广西五省进行样品采集，每省选择2个县(市、区)，根据实地情况采集鸭鹅规模场、活禽交易市场、屠宰场和自然村。每一采样地采集表观健康水禽咽喉/泄殖腔拭子30份，环境样品5份，屠宰场另加采鸭肝脾组织20份。拭子样品采集后放入含有双抗的生理盐水中，所有样品置于冰盒尽快送往实验室进行处理，或置于-70 ℃备用。在采集样品的同时，对采样地的水禽种类、品种，养殖规模，养殖方式，既往病史，疫苗免疫情况等方面进行问卷调查。

1.3病毒核酸提取

取肝、脾组织样品0.1 g于2 mL平底离心管中，加1粒钢珠和1 mL PBS(pH7.2)，放入TissueLyser II组织研磨Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统仪中研磨5 min，10 000 r · min-1离心1 min后取上清，与拭子液和环境样品液一同进行核酸提取。按照5×MagMAXTM-96 Viral Isolation Kit使用说明书，采用Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统提取病毒核酸。最后将病毒核酸洗脱至50 μL无菌去离子水中，-20 ℃保存备用。

1.4引物设计和荧光定量PCR扩增

根据国标GB/T22332-2008中的DPV目的片段和GPV保守基因VP3全长设计荧光定量PCR引物及探针；DTMUV和DHAV-1的荧光定量PCR引物及探针(表1)分别根据S.Li等[1]和M.Yang等[2]的报道进行设计。引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成。

DPV和GPV荧光定量PCR反应体系为2×GoTaq Probe qPCR Master Mix 10 μL，10 pmol·L-1相应上下游引物对0.8 μL，10 pmol·L-1探针0.4 μL，灭菌去离子水6.8 μL，病毒核酸模板2 μL，混匀后置于7500实时荧光定量PCR系统中进行扩增。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。出现典型的扩增曲线时，判定为DPV或GPV感染阳性。

DTMUV和DHAV-1荧光定量RT-PCR反应体系为2×RT-PCR反应液 10 μL，10 pmol· L-1相应上下游引物对0.8 μL，10 pmol·L-1探针0.4 μL，25×RT-PCR酶混合液0.8 μL，灭菌去离子水6 μL，病毒核酸模板2 μL，混匀后置于7500实时荧光定量PCR系统中进行扩增。反应条件：45 ℃ 10 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40个循环。出现典型的扩增曲线时，判定为DTMUV或DHAV-1感染阳性。

1.5数据分析

荧光定量PCR检测结果为阳性则判定该动物为DPV/DHAV-1/GPV/DTMUV阳性动物，只要被检场/村检出1只DPV/DHAV-1/GPV/DTMUV阳性动物则判定该场/村为阳性场/村。计算各省被检样品的DPV/DHAV-1/GPV/DTMUV阳性率及所有被检中小规模场、活禽交易市场、屠宰场和自然村的场/村阳性率和个体阳性率。

个体阳性率=阳性动物数/被检动物总数×100%

场/村阳性率=阳性场(村)数/被检场(村)数×100%

1.6阳性样品特异性片段扩增及序列分析

根据曹贞贞[3]报道测定DTMUV全长的19对引物，以及李昌主等[4]报道的DPVTK基因全长引物，分别选择有代表性的DTMUV和DPV阳性样品进行RT-PCR和PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定为目的片段后，连接到pEASY-T3载体中，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，挑取单个克隆进行PCR鉴定。每个片段选取三个阳性克隆送北京英潍捷基公司测序。

利用Lasergene软件，对所得序列进行拼接，并与已发表的DTMUV及DPV代表株进行比对，采用MEGA软件对核苷酸相似性较高的序列进行进化树分析。

2　结　果

2.1调查水禽和样品信息

共采集13个规模鸭场、8个规模鹅场、15个自然村、13个活禽交易市场和3个屠宰场的1 199份鸭咽喉/泄殖腔拭子、411份鹅咽喉/泄殖腔拭子、242份环境样品和79份鸭肝脾组织样品，共计1 931份。所调查规模场以饲养地方鸭鹅品种为主，多以自繁自养和活禽购入方式进行繁育，其中水养场11个，旱养场7个，水养旱养结合的场3个。规模鸭场中蛋鸭场4个，肉鸭场9个。所调查活禽市场、自然村中有樱桃谷、番鸭、半番鸭等肉鸭品种和麻鸭等蛋鸭品种。

2.2水禽群中的DTMUV、DPV、DHAV-1和GPV感染情况

安徽、浙江、福建、广东和广西五省的1 931份样品检测结果显示，有9.6%的水禽场/村检出DTMUV阳性样本，个体阳性率为1.2%(23/1 931)，阳性样本来自广东和广西；有1.9%水禽场/村检出DPV阳性样本，个体阳性率为0.3%(4/1 520)，阳性样本来自广东；未检出DHAV-1和GPV，且无混合感染的情况(表2)。

2.2.1不同来源的DTMUV和DPV感染情况在调查的2个规模鹅场、2个活禽市场和1个屠宰场的水禽中检出DTMUV阳性样本，其场内阳性率分别为46.7%、2.9%、1.4%、1.8%、19.4%，自然村散养户的水禽中没有检出DTMUV阳性样本(表3)。根据问卷调查，DTMUV阳性屠宰场的鹅可能来源于同地区的规模鹅场。在调查的1个活禽市场的鸭中检出DPV阳性样本，其场内阳性率为28.6%(表3)。

2.2.2不同样品的DTMUV和DPV感染情况鸭咽喉/泄殖腔拭子、鹅咽喉/泄殖腔拭子中的DTMUV检出率分别为0.2%和5.1%，鸭组织和环境样本中没有检出DTMUV阳性样本(表3)。该结果显示，DTMUV的鹅源阳性样本多于鸭源阳性样本。鸭咽喉/泄殖腔拭子中的DPV检出率为0.3%，鸭组织和环境样本中也没有检出DPV阳性样本(表3)。

2.3阳性样品序列分析

选取广东省DTMUV阳性规模鹅场的阳性鹅咽喉/泄殖腔拭子G23进行该病毒的全基因组测序，由于拭子样品病毒含量有限，3′端未能测通，已获得的序列拼接后共10 881 nt，提交至GenBank，获得序列号KT239021。经比对其核苷酸序列与2011年分离自广西蛋鸭毒株GX_2011(GenBank：KC990542)[5]相似性相似性最高，可达98.9%(10 757/10 882)；与已报道全序列的鹅源毒株相比，与2012年首次报道的鹅源毒株ZJ GH-2(GenBank：JQ314465)[6]相似性最高，为98.4%(10 709/10 882)。已获得的序列中包含一个完整CDS，长10 278 nt，编码3 425 aa，采用MEGA6.0构建基于该CDS核苷酸的遗传进化树，由图1可见，G23与我国多地及泰国的分离株亲缘关系较近，与马来西亚的分离株则相对较远，其中与2013年报道的分离自广西鸭的GX_2011和2012年报道的分离自广东番鸭的WJ-1株亲缘关系最近，位于同一分支内，相似性达98.4%以上。

选取广东省DPV阳性活禽市场的阳性鸭咽喉/泄殖腔拭子92D36对其TK基因进行测序，结果显示所测得的1 275 bp与1962年分离的CV株(GenBank：JQ673560)相似性最高，达99.9%(1 274/1 275)。

3　讨　论

表观健康的水禽亦可携带禽流感病毒[7]、新城疫病毒[8]，但携带其他水禽相关疫病病原(如鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒)的情况则鲜有研究。我国华东、华南地区水网密集，一直以来都是我国水禽养殖的主要区域，但也是水禽疫病多发的地区。如鸭瘟、鸭病毒性肝炎和小鹅瘟等在我国已流行有五十多年的疫病近几年在华东、华南地区也频有发生[9]。新发水禽疫病也多从这些地区始发，2010年在我国首次暴发的水禽新疫病鸭坦布苏病毒病就是从浙江等省最先出现，而后迅速蔓延至我国华北、东北等省市。因此，了解该区域表观健康水禽携带病毒的情况，对科学防控水禽疫病显得尤为重要。

本研究中作者对安徽、浙江、福建、广东和广西五省采集的表观健康水禽拭子、鸭组织及环境样本通过荧光定量PCR/荧光定量RT-PCR检测鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒1型、小鹅瘟病毒以及鸭坦布苏病毒。结果显示，表观健康鸭可从拭子样品中检出鸭瘟病毒，这与国外文献报道的健康水禽可携带鸭瘟病毒[10]一致。推测是由于鸭瘟病毒能持续感染水禽，并可长期经粪便和口分泌物进行排毒所致。鸭瘟属于我国二类疫病，列入疫情报告系统，但尚无国家主动监测计划和相应的防控技术规范。该病目前尚无特效治疗药物，因此免疫预防显得尤为重要。已批准的鸭瘟疫苗有鸭瘟活疫苗、鸭瘟活疫苗(鸡胚化弱毒株)、鸭瘟灭活疫苗和鸭瘟灭活疫苗(AV1221株)四种，免疫效果良好[9]。但从调查问卷反馈的情况来看，免疫情况不容乐观。首先，规模鸭场仍存在不免疫的情况。本次调查的13个规模鸭场中进行鸭瘟病毒免疫的仅有8个，有38%的鸭场尚不进行免疫。其次，自然村散养户对该病的免疫意识较差。本次调查共涉及15个自然村，其中养鸭的有44户散养户，无一免疫，增加了该病传播的风险。本研究中检出的鸭瘟病毒阳性样品来自广东三水区某活禽市场，所采集的鸭亦未免疫，因此也排除了免疫后排毒的可能，提示存在野毒感染。

图1　G23(框内)与多株DTMUV病毒CDS核苷酸同源进化树分析Fig.1　Bayesian phylogeny of the CDS nucleotide sequence of G23 (showed in frame) and DTMUV reference strains

鸭坦布苏病毒自2010年出现以来，已广泛流行于我国水禽养殖的多个省市[11]，目前已从鸭、番鸭、鹅、鸡[12]以及麻雀[13]、鸽子[14]和蚊子[15]中发现该病毒，也有研究从养鸭场工作人员的血清和口腔拭子中检出相应抗体和病毒RNA[16]。由于该病毒主要感染鸭，因此研究多集中于发病鸭群，对表观健康动物带毒的情况尚无相关研究。本研究结果表明，表观健康的鸭鹅亦可携带鸭坦布苏病毒，同时鹅坦布苏病毒的携带率高于鸭，推测这可能与不同动物宿主对该病毒的易感性存在差异有关。有文献指出从病鸭泄殖腔拭子中也可分离到病毒，但本研究中采用阳性拭子液接种9日龄鸭胚和8日龄鸡胚，盲传三代均未见死亡，推测是由于表观健康鸭鹅拭子的带毒量有限，不足以造成胚体死亡所致。此外，本次研究中，阳性率较高的规模场和屠宰场来自广东同一个地区，根据流行病学调查问卷显示，屠宰场动物来自规模场，说明表观健康但携带病原的水禽具备在环境中传播病毒的能力。另外，鸭坦布苏病毒在这五年间并未出现明显的变异，而且分离株无明显地域差异。本研究中表观健康鸭鹅所携带的毒株与临床分离的致病毒株相似性较高，尤其与两广地区的流行株亲缘关系更近，综合以上条件，这类水禽在不同地区调运过程中极易造成病毒的快速传播，应引起动物疫病防控部门的注意。

鸭甲型肝炎病毒1型和小鹅瘟病毒在我国流行已有50年之久，但至今仍未得到有效控制，每年还会造成雏鸭和雏鹅死亡，对水禽养殖业的发展影响极大[9]。这两种疫病主要感染幼龄动物，死亡率较高，青年和成年水禽感染后多不表现临床症状，但病毒可在体内不断繁殖进而不断排毒。本研究中所有样品均未检出鸭甲型肝炎病毒1型和小鹅瘟病毒，提示所检禽群可能并未感染这两种病毒。

4　结　论

表观健康的鸭鹅亦可携带鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒，且其所携带的毒株与临床分离的相应致病株相似性较高。提示在疫病传播过程中，应有针对性地开展水禽疫病主动监测，防止由于表观健康动物携带病原进而造成疫病的扩散传播。

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(编辑白永平)

Epidemiologic Investigation of Four Viruses Carried by Ducks and Geese in China

LIU Yang，WANG Chuan-bin，HUO Si-qi，ZHAI Xin-yan，XIN Sheng-peng，LIU Yu-liang，HAN Xue，ZHANG Qian，YANG Wei-zheng，GU Xiao-xue

(ChinaAnimalDiseaseControlCentre，Beijing100126，China)

To investigate the prevalence of duck plague virus (DPV)，duck hepatitis virus type 1 (DHAV-1)，goose parvovirus (GPV) and duck Tembusu virus (DTMUV) carried by duck and goose flocks in China，1 931 samples were collected from clinically healthy ducks and geese in Anhui，Zhejiang，Fujian，Guangdong and Guangxi provinces in November，2014.The four viruses above were detected by real-time PCR.DTMUV and DPV were detected in these specimens with a positive rate of 1.2% and 0.3%，respectively，while no DHAV-1 or GPV was detected.Our results demonstrated the presence of DTMUV and DPV in clinically healthy duck and goose flocks，furthermore，the two viruses carried by duck and goose shared high similarities at the nucleic acid level with the corresponding clinical pathogenic strains.These findings highlight the necessity of active surveillance for healthy waterfowls，in order to prevent transmission of viruses.

duck plague virus；duck hepatitis virus type 1；goose parvovirus；duck Tembusu virus；epidemiologic investigation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.011

2016-02-29

农业技术试验示范项目(2130106)；科技基础性工作专项(2013FY113300)

刘洋(1985-)，女，山西大同人，兽医师，博士，主要从事水禽疫病及禽类细菌病的防控工作，E-mail：lysonna@163.com

顾小雪，E-mail：gxxjackie@163.com

S858.35.3

A

0366-6964(2016)08-1610-08