葡萄糖调节蛋白GRP78在小梁网细胞中的表达及临床意义

柴　芳　卓业鸿　杨新光▲.西安交通大学医学院附属广仁医院　陕西眼科医疗中心　西安市第四医院眼科，陕西西安　70004；.中山大学中山眼科中心　眼科学国家重点实验室，广东广州　50060

葡萄糖调节蛋白GRP78在小梁网细胞中的表达及临床意义

柴芳1卓业鸿2杨新光1▲
1.西安交通大学医学院附属广仁医院陕西眼科医疗中心西安市第四医院眼科，陕西西安710004；2.中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室，广东广州510060

目的 检测葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在体外培养的正常人小梁网细胞（NTM）及原发性开角型青光眼（POAG）患者小梁网细胞（GTM）中蛋白及mRNA表达差异及临床意义。 方法 将体外培养的NTM及GTM细胞分为衣霉素（Tm）组、十字孢碱（STS）组及对照组，采用Real-time PCR、Western blot方法检测药物处理6、24 h后小梁网细胞中GRP78mRNA及蛋白表达。结果原代培养的GTM细胞中GRP78表达水平明显低于NTM细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。Tm可增加NTM、GTM细胞中GRP78的表达，但后者的增高水平明显低于前者，差异有统计学意义（P＜0.05）。GTM细胞对STS的反应大于NTM细胞。结论 POAG患者小梁网细胞对内质网应激反应能力低下，GRP78表达明显下调，对损伤性刺激的敏感性增强，提示GRP78蛋白可能在内质网应激诱导产生的小梁细胞凋亡中起保护作用。

青光眼；小梁网细胞；内质网应激

青光眼为全球主要不可逆性致盲眼病，原发性开角型青光（primary open-angle glaucoma，POAG）是青光眼中的常见类型，其发病机制未明［1］。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是近年新崛起的青光眼发病机制研究热点。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）作为ERS的关键伴侣蛋白，其高表达是细胞对病理应激的重要防御机制之一［2-3］。近几年国内外广泛开展针对GRP78的作用机制研究，提出2型糖尿病、肿瘤患者细胞内GRP78呈高表达［4-6］。同时研究表明，GRP78对敏感神经元、缺氧晚期心脏组织具有保护作用，可抑制肝细胞内脂肪合成等［7-8］，其功能研究已引起生物学家们的广泛重视。本研究通过体外培养正常人小梁网细胞（NTM）及POAG患者小梁网细胞（GTM），采用衣霉素（Tunicamycin，Tm）、十字孢碱（Staurosporine，STS）药物处理细胞，运用Real-time PCR、蛋白质印迹（Western blot）等方法检测GRP78mRNA及蛋白的表达，发现GTM细胞中GRP78表达下调，对ERS的反应能力下降，对损伤性刺激的敏感性增强，最终导致功能异常和细胞凋亡。现将结果报道如下：

1　材料与方法

1.1药品与试剂

DMEM/F12培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、衣霉素（Tunicamycin，Tm）、十字孢碱（Staurosporine，STS）购于美国Sigma公司，逆转录试剂盒购于Fermentas公司，Western blot检测试剂盒购于Cell Signaling公司。

1.2实验分组

收集健康供体及青光眼患者小梁网组织进行原代培养并进行传代［9］。将第3代小梁网细胞接种于25 cm2培养瓶底，DMEM-F12培养液（含质量分数15%胎牛血清，60mg/L青霉素，100mg/L链霉索）培养。将NTM、GTM细胞接种于培养瓶，待细胞完全融合后，分别加入含有1μmol/L Tm培养液、0.1μmol/L STS培养液和不含上述任何药物的培养液，分为Tm组、STS组、对照组，每天换液，处理6～24 h。采用Realtime PCR、Western blot方法检测药物处理6、24 h后小梁网细胞中GRP78 mRNA及蛋白的表达。

1.3RNA提取和RT-PCR

样品总RNA提取：培养瓶中加入Trizol，吹打后移入离心管，振荡器混匀。加入氯仿，混匀、静置分层后，离心转上清于另一离心管中，加等体积异丙醇，离心后弃上清，加预冷的75%乙醇，再次离心后弃上清，ddH2O溶解沉淀。取RNA样品，检测RNA在230、260、280 nm处的吸光度，确定其质量、浓度；再进行琼脂糖电泳，检测RNA完整性；依Fermentas逆转录试剂盒程序进行逆转录。将上述逆转录所得DNA进行扩增，得到目的片段，从而在mRNA水平检测小梁网细胞GRP78的表达。采用DNA琼脂糖凝胶电泳，用四星图像分析系统对凝胶各泳道中的目的条带和内参条带进行光密度扫描，定量分析。实验重复3次。

1.4W estern blot检测

根据Western blot检测试剂盒说明提取细胞膜蛋白进行10%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，依次将Maker、各蛋白样品加入梳孔内，Maker上样量为5μL，其余每孔上样量为20μL（含总蛋白30μg），电压为恒压200 V，待溴酚兰指示剂跑至分离胶下缘时，停止电泳，再经转膜、封闭，一抗、二抗封闭后进行曝光检测，最后再入定影液10min，清水漂洗，晾干。用四星图像分析系统对免疫印迹结果进行定量分析。

1.5统计学方法

应用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析用Pearson检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1GRP78mRNA在人眼小梁网细胞中的表达

结果显示，GTM细胞GRP78mRNA表达水平较NTM细胞低，经Tm、STS药物处理后，表达差异仍有统计学意义（P＜0.05）；Tm处理后，NTM、GTM细胞内GRP78mRNA表达水平均上调，并且上调呈时间依赖性，最高表达量出现在Tm刺激24 h后；STS处理细胞后，NTM细胞内GRP78mRNA表达水平在6、24 h均上调，而GTM细胞内GRP78 mRNA表达水平在6 h上调，24 h下调。Tm、STS药物处理后，细胞内GRP78表达变化量与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1　各组GRP78 mRNA相对表达量比较（±s）

表1　各组GRP78 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与NTM比较，*P＜0.05，与对照组比较，#P＜0.05；Tm：衣霉素；STS：十字孢碱；NTM：正常人小梁网细胞；GTM：患者小梁网细胞

组别　NTM　GTM Tm组6 h 24 h STS组6 h 24 h对照组2.138±0.032#2.604±0.062#1.430±0.037*#1.732±0.049*#1.369±0.038#1.119±0.061#1.000±0.000 1.083±0.022*#0.583±0.035*#0.660±0.038*

2.2GRP78蛋白在人眼小梁细胞中的表达

结果显示，各组小梁细胞均有GRP78蛋白表达，GTM较NTM细胞表达水平低，经Tm、STS药物作用24 h后GTM细胞GRP78蛋白的表达量明显较NTM细胞低（P＜0.05）；Tm处理细胞后，NTM、GTM细胞内GRP78蛋白表达量均上调，并且呈时间依赖性，最高表达量出现在Tm刺激24 h；STS处理细胞后，NTM细胞内GRP78蛋白在药物处理6 h时上调，在药物处理24 h时下调；而GTM细胞内GRP78蛋白表达量均下调，下调量在STS刺激细胞24 h时表达最明显。Tm、STS药物处理细胞后，GRP78蛋白表达变化量与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图2～3。

图1　各组GRP78 m RNA相对表达量（表达量/内参表达量）

表2　各组GRP78蛋白相对表达量比较（±s）

表2　各组GRP78蛋白相对表达量比较（±s）

注：与NTM比较，*P＜0.05，与对照组比较，#P＜0.05；Tm：衣霉素；STS：十字孢碱；NTM：正常人小梁网细胞；GTM：患者小梁网细胞

组别　NTM　GTM Tm组6 h 24 h STS组6 h 24 h对照组1.495±0.018#2.664±0.074#1.088±0.031*#1.906±0.058*#1.042±0.038#0.793±0.023#1.000±0.003 0.406±0.033*#0.356±0.019*#0.805±0.042*

3　讨论

POAG占所有青光眼的85%～90%，小梁网部位房水外流阻力增大所造成的病理性眼压升高是引起青光眼视神经损害的重要原因。小梁网细胞的丢失势必影响小梁网的结构和功能，从而影响房水流出的效率，因而关于小梁网细胞凋亡的研究已成为探索开角型青光眼发病机制和治疗手段的有效方法之一［10-12］。

ERS是细胞内质网稳定失衡、生理功能发生紊乱时，细胞为维持细胞内环境稳定而保持细胞生存启动的自我保护反应机制［13-15］。ERS可促进内质网腔中未折叠或错误折叠蛋白质的加工处理，通过减少新生蛋白质、降解未折叠蛋白及维持细胞内钙的平衡，从而促进细胞内环境稳态的恢复，保持细胞的正常功能和维持细胞存活。当ERS过强过久时可启动凋亡通路引发细胞功能异常，最终导致细胞死亡；当ERS能力低下时，有效的细胞保护机制减少，细胞对损伤性刺激因素的敏感性增加而导致或加速细胞的死亡［16-17］。

图2　药物刺激下NTM、GTM GRP78蛋白表达条带

图3　各组GRP78蛋白相对表达量（表达量/内参表达量）

GRP78位于真核生物细胞的内质网膜上，与热休克蛋白70（Hsp70）家族具有高度同源性，被认为是Hsp70家族的成员之一。GRP78的表达变化被认为是ERS未折叠蛋白质反应的标志；在低糖、低氧、低Ca2+等应激反应调节时其基因的转录活性可提高10～25倍，表达量显著增高，从而维持了内质网钙稳态及内环境的稳定。因此，近年来认为细胞受刺激时GRP78呈高表达并合成GRP78的反应，可能是细胞的一种重要防御机制，该机制对细胞有保护作用从而延长在各种不利因素刺激下的细胞生存期［18-20］。然而，本研究通过Real-time PCR、Western blot检测在NTM细胞及GTM细胞内GRP78mRNA及蛋白的表达，结果显示各组小梁网细胞均有GRP78表达，GRP78在GTM细胞内的表达水平较NTM细胞表达水平低。

Tm是细胞产生ERS的诱发因素。为了进一步证实GTM细胞内GRP78表达下调是由于细胞对ERS反应能力低下，本研究给予Tm药物处理，结果显示：NTM、GTM细胞经Tm处理后，GRP78 mRNA及蛋白质表达量显著增加；GTM细胞GRP78表达水平的增加量明显低于NTM。该结果表明NTM及GTM细胞在ERS刺激下均能产生相应的应激反应，然而，后者对ERS刺激的反应能力明显低于前者。

STS以0.1μmol/L的浓度培养细胞6～24 h，结果显示：NTM、GTM细胞内GRP78蛋白表达量均下调；GTM细胞GRP78表达下调明显大于NTM。以上结果提示，GTM细胞由于保护性GRP78蛋白下调，细胞内促生存因素下降，自身内质网防御功能被破坏，进而导致细胞对凋亡刺激敏感性增大。

目前的研究已经明确了GRP78的生物学特性和细胞保护作用，GRP78的表达多少对决定应激细胞的结局，如抵抗、适应、损伤或凋亡等有重要作用，所以这方面的研究无论在科学理论还是在应用前景上都具有重大意义。本实验结果显示，GTM细胞内GRP78表达下降且对ERS的反应低下，表明其防御体系被破坏，增加了细胞对损伤性刺激的敏感性，可能加速或导致小梁细胞的死亡，为POAG的后期干预治疗提供了有效靶点。

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Expression and clinical significance of GRP78 in human trabecular meshwork cells

CHAI Fang1ZHUO Yehong2YANG Xinguang1▲
1.Department of Ophthalmology，Xi'an No.4 Hospital Ophthalmic Medical Center of Shaanxi Province Guangren Hospital Affiliated to School of Medicine，Xi'an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi'an710004，China；2.Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-Sen University State Key Laboratory of Ophthalmology，Guangdong Province，Guangzhou 510060，China

Objective To detect protein and mRNA expression differences of GRP78 in human trabecular meshwork cells of normal eyes（NTM）and POAG patients（GTM）in vitro.M ethods Human trabecular meshwork cells from NTM and GTM in vitro were divided into 3 groups:Tunicamycin（Tm）group，Staurosporine（STS）group and control group. Real-time RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of mRNA and protein of GRP78 in trabecular meshwork cells after 6，24 h treatment.Results The expression of GRP78 in primary culture GTM cells was significantly lower than that in NTM cells，with statistically significant difference（P＜0.05）.Tm could increase the expression of GRP78 in NTM and GTM cells，the expression in GTM cells was lower than that in NTM cells，with statistically significant difference（P＜0.05）.The response of GTM cells for STS was bigger than NTM cells.Conclusion GTMs showed insensitivity reactions when stimulated with inducer of endoplasmic reticulum stress，reduce the expression of GRP78，lead to the increased sensitivity of GTMs to damage stimulus.GRP78may play a cytoprotective role in the apoptosis in trabecular meshwork cells caused by endoplasmic reticulum stress.

Glaucoma；Trabecular meshwork cells；Endoplasmic reticulum stress

R775

A

1673-7210（2016）01（c）-0114-04

2015-10-20本文编辑：程铭）

国家自然科学基金项目（81273902）；陕西省西安市重点学科优势专科建设项目（［2015］228号-7）。