肺癌组织中m iRNAs的表达及其与Oct4、K lf4的关系

朱　捷　徐　驰　杨鲸蓉　曾志勇▲.南京军区福州总医院心胸外科，福建福州　35000；2.第二军医大学研究生院，上海　200433

肺癌组织中m iRNAs的表达及其与Oct4、K lf4的关系

朱捷1，2徐驰1杨鲸蓉1曾志勇1▲
1.南京军区福州总医院心胸外科，福建福州350001；2.第二军医大学研究生院，上海200433

目的 研究肺癌组织中miRNAs的表达及其与Oct4、Kruppel样因子 （Klf4）的关系。方法 选择2013年4月～2014年8月期间在南京军区福州总医院接受肺癌根治术的50例患者进行研究，收集肺癌组织和癌旁正常组织，检测Oct4、Klf4的mRNA含量以及miR-335、miR-339、miR-361、miR-200c、miR-148、miR-29的表达量，分析Oct4、Klf4的mRNA含量与miRNAs表达量的关系。结果 肺癌组织中Oct4的mRNA含量（231.12±29.49）高于癌旁正常组织的 （100.00±13.49），t=16.965，P＜0.05；Klf4的mRNA含量 （34.58±5.59）低于癌旁正常组织的（100.00±15.02）（t=21.344，P＜0.05）；TNM分期越高，肺癌组织中Oct4的mRNA含量越高，Klf4的mRNA含量越低，F值分别为18.812、20.193（P＜0.05）；分化程度越低，肺癌组织中Oct4的mRNA含量越高、Klf4的mRNA含量越低，F值分别为16.877、23.485（P＜0.05）；肺癌组织中miR-335、miR-339、miR-361的表达量分别为（25.68± 3.42）、（34.15±4.85）、（18.49±1.95），低于癌旁组织的（100.00±12.38）、（100.00±11.69）、（100.00±14.04）（均P＜0.05），并且与Oct4的mRNA含量呈负相关；miR-200c、miR-148、miR-29的表达量 ［（243.45±30.45）、（313.68± 36.58）、（278.69±32.48）］高于癌旁组织 ［（100.00±13.59）、（100.00±15.02）、（100.00±13.48）］（均P＜0.05）；并且与Klf4的mRNA含量呈负相关。 结论 肺癌组织中miR-335、miR-339、miR-361及miR-200c、miR-148、miR-29可能分别通过上调或下调Oct4、Klf4的表达来参与肺癌的发生发展。

肺癌；microRNA；Oct4；Kruppel样因子

肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤，手术切除仍是临床治疗肺癌最有效的方式，辅助以术后放化疗、生物靶向治疗等措施能够有效地延长患者的生存时间。尽管如此，患者在接受综合治疗措施后的复发率仍较高，复发病灶对放化疗以及生物靶向药物不敏感会导致病情迅速发展，最终造成死亡。目前，肺癌发病的潜在分子机制仍未阐明。Oct4和Kruppel样因子4 （Klf4）是参与细胞增殖调控的两类转录因子，与多种恶性肿瘤的发生相关［1-2］，检测肺癌组织中Oct4和Klf4的表达量、探索上游调控机制有助于阐明肺癌发生的分子机制。近年来有研究显示，miRNAs表达异常与肺癌的发生密切相关并且能够通过与mRNA3'UTR区域结合来调节基因表达，可能参与Oct4 和Klf4表达的调控［3-4］。本研究分析了肺癌组织中miRNAs表达量及其与Oct4、Klf4表达量的关系。

1　资料与方法

1.1研究对象

选择2013年4月～2014年8月在南京军区福州总医院胸外科接受肺癌根治术的50例患者进行研究，所有患者经病理学检查诊断为肺癌，包括男32例、女18例，年龄43～67岁，平均（52.39±6.82）岁。本研究获得医院伦理委员会批准后告知研究事项和手术风险，取得患者知情同意后进行肺癌根治术。术中取肺癌组织和癌旁正常组织，经病理检查确认肺癌组织和癌旁正常组织的性质后用于下一步研究。

1.2研究材料

RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒来自日本Takara公司；miRNA提取试剂盒、miRNA反转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒来自德国Qigen公司；PCR仪来自美国ABI公司。

1.3研究方法

1.3.1RNA抽提和检测方法取肺癌组织和癌旁组织，采用RNA提取试剂盒抽提组织中的总RNA，采用RNA反转录试剂盒、通过OligoDT18将mRNA反转录为cDNA，而后进行荧光定量PCR反应，扩增条件如下：95℃变性，15 s，特异性退火温度，15 s，72℃延伸25 s，重复40个循环。扩增基因包括Oct4、Klf4，扩增引物及特异性退火温度见表1。

1.3.2mi RNA抽提和检测方法取肺癌组织和癌旁组织，采用miRNA提取试剂盒抽提组织中的总miRNA，采用RNA反转录试剂盒对miRNA进行加尾处理、取加尾样本进行反转录并得到miRNA对应的cDNA；而后进行荧光定量PCR反应，退火温度参照试剂盒均为60℃，扩增条件如下：95℃变性，15 s，60℃退火和延伸，35 s，重复40个循环。扩增基因包括miR-335、miR-339、miR-361、miR-200c、miR-148、miR-29，扩增引物见表1。

表1　PCR引物序列及退火温度

1.4统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行录入和分析，两组间比较采用t检验，三组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，相关性分析采用Pearson检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肺癌组织和癌旁正常组织中Oct4、Klf4的表达量

肺癌组织中Oct4的mRNA含量高于癌旁正常组织，Klf4的mRNA含量低于癌旁正常组织，肺癌组织和癌旁正常组织中Oct4、Klf4表达量比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2　肺癌组织和癌旁正常组织中Oct4、Klf4的mRNA含量比较（±s）

表2　肺癌组织和癌旁正常组织中Oct4、Klf4的mRNA含量比较（±s）

注：Klf4：Kruppel样因子4

组织　样本量　Oct4　Klf4肺癌组织癌旁正常组织50 50 t值　P值231.12±29.49 100.00±13.49 16.965 ＜0.05 34.58±5.59 100.00±15.02 21.344 ＜0.05

2.2不同TNM分期肺癌组织中Oct4、Klf4的表达量

不同TNM分期肺癌组织中Oct4、Klf4的mRNA含量有差异，t检验示不同TNM分期肺癌组织中Oct4、Klf4表达量比较差异有统计学意义 （均P＜0.05）；LSD-t检验进行两两比较显示，TNM分期越高，Oct4的mRNA含量越高，Klf4的mRNA含量越低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

表3　不同TNM分期肺癌组织中Oct4、Klf4的mRNA含量比较（±s）

表3　不同TNM分期肺癌组织中Oct4、Klf4的mRNA含量比较（±s）

注：Klf4：Kruppel样因子4；与TNMⅠ期比较，*P＜0.05；与TNMⅡ期比较，#P＜0.05

分期　样本量　Oct4　Klf4 TNMⅠ期TNMⅡ期TNMⅢ期F值P值11 14 15 131.38±16.65 189.23±23.14*292.34±30.26*#18.812 ＜0.05 82.34±9.23 47.76±6.44*21.52±4.40*#20.193 ＜0.05

2.3不同分化程度肺癌组织中Oct4、Klf4的表达量

不同分化程度肺癌组织中Oct4、Klf4的mRNA含量有差异，t检验示不同分化程度肺癌组织中Oct4、Klf4表达量比较差异有统计学意义 （均P＜0.05）。LSD-t检验进行两两比较显示，分化程度越低，Oct4 的mRNA含量越高、Klf4的mRNA含量越低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表4。

表4　不同分化程度肺癌组织中Oct4、Klf4的m RNA含量比较（±s）

表4　不同分化程度肺癌组织中Oct4、Klf4的m RNA含量比较（±s）

注：Klf4：Kruppel样因子4；与高分化组织比较，*P＜0.05；与中分化组织比较，#P＜0.05

分化程度　样本量　Oct4　Klf4高分化中分化低分化F值P值17 19 14 154.23±20.12 242.59±30.35*352.30±40.18*#16.877 ＜0.05 76.67±8.89 33.49±4.41*13.59±1.66*#23.485 ＜0.05

2.4肺癌组织和癌旁组织中m iRNAs的表达量

肺癌组织中miR-335、miR-339、miR-361的表达量低于癌旁正常组织，miR-200c、miR-148、miR-29的表达量高于癌旁组织。肺癌组织和癌旁正常组织中miRNAs表达量比较差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表5。

2.5肺癌组织中m iRNAs表达量与Oct4、Klf4的mRNA的相关性

肺癌组织中miR-335、miR-339、miR-361的表达量与Oct4的mRNA含量呈负相关 （P＜0.05），miR-200c、miR-148、miR-29的表达量与Klf4的mRNA含量呈负相关（P＜0.05）。见表6。

3　讨论

Oct-4蛋白由Pou5f1基因编码，是一类含有Pou结构域的转录因子，对于维持胚胎干细胞的多能性和自我更新性具有重要意义［5］。最初关于Oct-4的研究多集中在尚未分化的细胞，该转录因子既能够使某些细胞继续处于未分化状态，又能使某些细胞向某一类型细胞分化［6］。近年来的多项研究提示，Oct-4高表达与已分化体细胞的无限增殖有关，进而参与乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肺癌等恶性肿瘤的发生过程［7-9］。本研究对肺癌组织中Oct-4表达量的检测显示，肺癌组织中Oct-4的mRNA含量高于癌旁组织；且肿瘤的分化程度越低，Oct-4的mRNA含量越高，肿瘤的TNM分期越高，Oct-4的mRNA含量越高。

表5　肺癌组织和癌旁正常组织中m iRNAs的表达量比较（±s）

表5　肺癌组织和癌旁正常组织中m iRNAs的表达量比较（±s）

组织　miR-335　miR-339　miR-361　miR-200c　miR-148　miR-29肺癌组织癌旁正常组织t值P值25.68±3.42 100.00±12.38 25.952 ＜0.05 34.15±4.85 100.00±11.69 20.944 ＜0.05 18.49±1.95 100.00±14.04 34.283 ＜0.05 243.45±30.45 100.00±13.59 15.482 ＜0.05 313.68±36.58 100.00±15.02 18.866 ＜0.05 278.69±32.48 100.00±13.48 17.182 ＜0.05

表6　肺癌组织中m iRNAs表达量与Oct4、Klf4的m RNA相关性分析（±s）

表6　肺癌组织中m iRNAs表达量与Oct4、Klf4的m RNA相关性分析（±s）

注：Klf4：Kruppel样因子4

扩增基因Oct4的mRNA含量回归系数（b）相关系数（r）　P值Klf4的mRNA含量回归系数（b）相关系数（r）　P值miR-335 miR-339 miR-361 miR-200c miR-148 miR-29 -1.023 -0.686 -0.914 -1.482 -0.668 -0.706 -0.786 -0.714 -0.807 -0.697 -0.790 -0.817 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 -0.675 -0.901 -0.884 -1.197 -1.392 -0.839 -0.882 -0.791 -0.767 -0.838 -0.809 -0.731 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

Klf4是真核细胞内特有的一类含有3个锌指结构的转录因子，能够识别SP1的GC结合位点并进行竞争性结合、抑制SP1下游靶基因CyclinD1的表达，进而阻遏细胞周期的发展以及细胞的增殖［10］。近年来越来越多的研究将Klf4视作肿瘤抑制因子，胃癌、食管癌等消化道恶性肿瘤的相关研究发现Klf4低表达与恶性肿瘤的发展有关［11-12］。本研究采用与Oct4相同的方法对肺癌组织中Klf4表达量的检测显示，肺癌组织中Klf4的mRNA含量低于癌旁组织；且分化程度越低，Klf4的mRNA含量越低，肿瘤的TNM分期越高，Klf4的mRNA含量越低。

通过以上对Oct4和Klf4表达量的分析可知，Oct4高表达和Klf4低表达与肺癌的发生以及病情的进展相关。但是，目前关于两种转录因子表达量发生变化的分子机制仍处于未知状态。microRNA是近年来兴起的表观遗传学调控分子，能够通过与mRNA 的3'UTR区域结合来调节多种转录因子的表达［13］。为了探明肺癌组织中miRNAs是否参与Oct4和Klf4表达的调控，首先对Oct4和Klf4 mRNA的3'UTR序列进行了生物信息学分析，在Oct4 mRNA的3'UTR上有 miR-125b、miR-145、miR-200c、miR-302、miR-324、miR-335、miR-339、miR-430、miR-449a、miR-595的结合位点，在Klf4mRNA的3'UTR上有miR-10b、miR147、miR-199、miR-205、miR-221的结合位点。由此推测上述miRNAs可能通过调节Oct4和Klf4的表达，进而参与肺癌的发生。

在上述生物信息学分析的基础上，本研究查阅了有关肺癌组织中miRNAs表达变化的相关研究发现，肺癌组织中miR-335、miR-339、miR-361、miR-200c、miR-148、miR-29的表达异常［14-20］。进一步对肺癌组织中miRNAs的表达量进行了验证并分析了miRNAs含量与相应靶基因Oct4、Klf4的相关性，检测和分析的结果显示，肺癌组织中miR-335、miR-339、miR-361的表达量低于癌旁组织且与Oct4的mRNA含量呈负相关，miR-200c、miR-148、miR-29的表达量高于癌旁组织且与Klf4的mRNA含量呈负相关。这就初步提示肺癌组织中miR-335、miR-339、miR-361的低表达可能通过增加Oct4的表达来参与疾病的发生，miR-200c、miR-148、miR-29的高表达可能通过减少Klf4的表达来参与疾病的发生。

综上所述，得出以下初步结论，肺癌组织中miR-335、miR-339、miR-361及miR-200c、miR-148、miR-29可能分别通过上调或下调Oct4、Klf4的表达来参与肺癌的发生发展。

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Expression of miRNAs in lung cancer and its correlation with Oct4，K lf4

ZHU Jie1,2XU Chi1YANG Jingrong1ZENG Zhiyong1▲
1.Department of Cardiothoracic Surgery，Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command，Fujian Province，Fuzhou350001，China；2.Graduate School，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China

Objective To study the expression of miRNAs in lung cancer and its correlation with Oct4，Klf4.Methods 50 cases of patients received lung resection in Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command from April 2013 to August 2014 were enrolled.Lung cancer tissue and adjacent normol tissues were collected.Then mRNA contents of Oct4，Klf4 andmiR-335，miR-339，miR-361，miR-200，，miR-148，miR-29 expression levels were detected，the correlation betweenmRNA contents of Oct4，Klf4 and miRNAs expression were analyzed.Results mRNA contents of Oct4 （231.12±29.49）in lung cancer were higher than those（100.00±13.49）in adjacent normal tissue（t=16.965，P＜0.05）；mRNA contents of Klf4（34.58±5.59）were lower than those（100.00±15.02）in adjacent normal tissue（t=21.344，P＜0.05）；the higher the TNM stage，the higher the Oct4 mRNA contents and the lower the Klf4 mRNA contents in lung tissue，F value was 18.812，20.193 separately（P＜0.05）；the lower the differentiation degree，the higher the Oct4mRNA contents and the lower the Klf4mRNA contents in lung tissue，F valuewas 16.877，23.485 separately（P＜0.05）；miR-335，miR-339，miR-361 contents［（25.68±3.42），（34.15±4.85），（18.49±1.95）］in lung cancer were lower than those［（100.00± 12.38），（100.00±11.69），（100.00±14.04）］in adjacentnormal tissue（P＜0.05）and negatively correlated withmRNA contents of Oct4；miR-200c，miR-148，miR-29 expression levels［（243.45±30.45），（313.68±36.58），（278.69±32.48）］in lung cancer were higher than those［（100.00±13.59），（100.00±15.02），（100.00±13.48）］in adjacent normal tissue（P＜0.05）and negatively correlated with mRNA contents of Klf4.Conclusion miR-335，miR-339，miR-361 and miR-200c，miR-148，miR-29 may participate in the occurrence of lung cancer by reducing the expression of Oct4 and Klf4. ［Key words］Lung cancer；MicroRNA；Oct4；Klf4

R730.21

A

1673-7210（2016）01（b）-0100-04

2015-09-08本文编辑：赵鲁枫）

朱捷（1986.7-），男，第二军医大学、南京军区福州总医院联合培养2014级外科学（心胸外科）专业在读硕士：研究方向：肺癌的基因治疗。