辛基酚聚氧乙烯醚混合菌的构建及响应面优化

刘文斌,张海涛,杨海君,刘亚宾,许云海



辛基酚聚氧乙烯醚混合菌的构建及响应面优化

刘文斌,张海涛,杨海君*,刘亚宾,许云海

(湖南农业大学植物保护学院,湖南 长沙 410128)

为提高辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)的生物降解效果,在本实验室已筛选出的H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23四株OPnEO高效降解菌的基础上,首次从构建OPnEO混合菌的角度,着重探究了四菌株等比例不同组合降解OPnEO的效果.结果表明,混合菌L9(H1∶TXBc10∶TXBa23为1∶1∶1)培养7d后对初始浓度500mg/LOPnEO的降解率最高,达到56.44%,比各单一菌株降解效果有较明显提高.运用单因素试验考察了影响L9的相关因素,初步确定L9降解OPnEO的最适外加碳源和氮源分别为葡萄糖和胰蛋白胨,最适初始pH值为7.0,最适温度为28 ℃,最适接种量为4%. Plackett-Burman试验筛选获得影响OPnEO降解率的3个显著因子为L9接种量、温度及初始pH值.最陡爬坡试验逼近3个显著因子的最大响应区域,采用Box-Behnken试验设计及响应面法分析,确定L9的最优降解条件为50mL反应体系中接种量4.16%、温度28.20 ℃、初始pH值7.13、葡萄糖与胰蛋白胨浓度均为2%、OPnEO初始浓度500mg/L、180r/min培养7d,该条件下混合菌L9对OPnEO降解率达62.15%,比未优化条件提高了5%左右.

辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)；混合菌；响应面法；生物降解

辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)是继脂肪醇聚氧乙烯醚之后,性能优异的第二大类非离子表面活性剂.广泛用于洗涤、纺织、皮革、造纸、农药等领域.然而,OPnEO自然降解性较差[1],生物积累性强[2-3],加之其降解产生的低分子量低聚物具有很强的环境雌激素效应[4-6],使其在使用过程中不可避免地产生了系列严重的环境污染.目前已在城市污水、地面水和饮用水、工业废水、河流及其底泥沉积物、海洋及其沿岸沉积物中检测到OP及其OPEO1和OPEO2的存在[7].

就目前的研究报道来看,对非离子表面活性剂污染治理的研究主要集中在烷基酚和壬基酚,且研究重点均放在该类表面活性剂的危害、吸附行为、测定方法、降解菌的筛选与鉴定以及应用方面[8-16].而作为产量高、环境雌激素效应强的OPnEO污染的生物治理技术最近才发展起来,且主要集中在OPnEO高效降解菌的筛选及分离菌对OPnEO降解能力等理论研究方面[17-20].大部分降解菌虽可直接应用,但这些分离、筛选得到的降解菌往往在实际污染环境中的耐受性差、可利用性低,甚至某些降解菌在实际利用中失活.虽然优势混合菌在废水污染物的降解及废物资源化中已有较多报道[21-22],但其在降解表面活性剂特别是OPnEO污染的研究才刚刚开始,鲜有报道.

本研究将在前期实验已筛选的H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23四株辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)高效降解菌的基础上,通过等比例组合实验,构建出高效降解OPnEO的混合菌.并利用响应面法(RSM)优化混合菌降解OPnEO的条件以提高其降解效率.

1 材料与方法

1.1 实验材料与培养基

1.1.1 菌种来源 醋酸钙不动杆菌H1 (H1)[18]、气单胞菌TXBc10(sp. TXBc10)、柠檬酸细菌OPQb11(sp. OPQb11)、假单胞菌TXBa23(sp. TXBa23)[19]均由本实验室从湖南裳海迪瑞特服装有限公司污水处理的曝气池和排污口废水中筛选获得.

1.1.2 培养基 LB培养基:酵母浸出物 5.0g,胰蛋白胨 10.0g,NaCl 10.0g,TX-100(OPnEO, n=9- 10)0.5g,H2O 1000mL,pH7.0,若配制固体培养基,则加1.5-2%琼脂.无机盐培养基(MS):K2HPO40.4g,KH2PO40.4g,NaCl 0.1g,(NH4)2SO40.04g, MgSO4·7H2O 0.1g,MnSO4·H2O 0.01g, Fe2(SO4)3·H2O 0.01g,NaMoO4·2H2O 0.01g, H2O1000mL,pH7.0.

1.2 实验方法

1.2.1 辛基酚聚氧乙烯醚高效降解菌的活化 将保存在-80 ℃冰箱中的OPnEO高效降解菌H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23取出溶化后,分别接种到50mL LB培养基中,28 ℃、180r/min 振荡培养14~16h后,挑选部分茁壮的菌落接种到新的LB培养基中培养,重复此步骤2~3次,从而得到生长良好的菌落.

1.2.2 混合菌的构建 将LB培养基中培养24h的菌液离心(10000r/min)后,用生理盐水(NaCl 0.85%)重悬制成菌悬液,并在600nm下测其光密度,并加入适量无菌生理盐水调节菌浓度,使4菌株OD600均为1.0左右,然后将浓度一致的4种菌等比例混合,构建不同的混合菌,并将其按4%接种到50mL含500mg/L OPnEO的无机盐液体培养基中,振荡培养(28℃、pH7.0、180r/min)7d后取样,用高效液相色谱法(AGILENT 1100)测定OPnEO含量[23-24],计算OPnEO的降解率.选取降解率最高的混合菌进行后续试验.

1.2.3 环境因素对混合菌降解效率的影响 通过单因素试验,分别研究温度、pH值、底物浓度、接种量、外加碳源和氮源对混合菌降解OPnEO的影响.将混合菌接种到含500mg/L OPnEO的无机盐液体培养基中,180r/min振荡培养7d后取样,并用高效液相色谱法(AGILENT 1100)测定OPnEO含量,计算OPnEO的降解率.标准试验:接种量为4%、28℃、pH7.0、180r/min、50mL无机盐培养基反应体系.温度分别为15、20、25、28、30、35和40℃;pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0;底物浓度分别为50、100、200、500、800、1000和1500mg/L;接种量分别为0.5%、1%、2%、4%、8%和10%;外加碳源分别为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸、乳糖、乙酸钠、山梨醇、明胶和木糖,外加氮源分别为牛肉膏、尿素、硝酸钾、胰蛋白胨、硝酸铵、酵母粉、乙酸铵、氯化铵和硫酸铵,添加量均为2%.

1.2.4 L9降解OPnEO的最优条件研究 在单因素试验的基础上,采用N=12Placket-Burman 试验设计研究温度、pH值、底物浓度、接种量、培养时间、外加碳源和氮源7个因素对混合菌降解OPnEO的影响(表1),每个处理3个重复.根据Plackett-Burman试验结果,利用最陡爬坡路径方法确定重要因子的最适浓度范围[25],并根据最陡爬坡试验结果进行Box-Behnken试验设计,利用Design-Expert.8.05b软件分析最优值.

表1 Placket-Burman试验因素及水平 Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels

注:Dummy1~4为空白因素.

2 结果与分析

2.1 混合菌降解OPnEO效率

不同混合菌降解OPnEO的效率明显不同.与单一菌株相比,有些混合菌能在一定程度上提高OPnEO的降解率,另一些混合菌的降解率却下降.由此可见,单纯的把各单菌株简单的组合在一起,降解效果并不一定都会提高,这可能是菌株间的拮抗作用所致.在所有混合菌组合中,9号混合菌(命名为L9, H1:TXBc10:TXBa23=1:1:1)的降解率最高,为56.44%,比单菌株高8.63%~ 15.44%,选其进行后续试验.

表2 混合菌降解OPnEO的效率 Table 2 Effect of OPnEO degradation by the mixed bacteria

注:表中"1" 代表接种菌株,"0" 代表未接种菌株.各菌株间等比例投加,总接种量为4%.

2.2 环境因素对L9降解效率的影响

2.2.1 温度对L9降解效率的影响 由图1可知,温度对L9降解OPnEO有显著性影响.随着温度的升高,L9的降解效率先升高后降低.在25~30℃时,L9的降解率较高;当温度低于25℃或高于30℃时,L9的降解率显著下降.当温度为28℃时, L9的降解率最高,为56.24%,分别为15℃和40℃的2倍和4倍,这表明L9与大多数环境微生物对温度的敏感程度一致,过高或过低的温度都会严重影响菌株体内相关酶的活性,从而导致菌株代谢能力降低、生长受到抑制.

2.2.2 pH值对L9降解率的影响 由图2可知,pH5~10时L9对OPnEO的降解率出现了较大的起伏.当pH在7~9时, L9对OPnEO具有较高的降解率,且当pH为7.0时,L9对OPnEO降解效果达到最佳,此时OPnEO的降解率为55.68%,故初步判断最适pH为7.0.而当pH为5或10时,L9对OPnEO的降解能力急剧降低,这与过高或过低的pH值会使微生物体内酶失活,不利于微生物生长繁殖有关.总之,L9适应中性偏弱碱性环境,与大多数微生物对pH的适应范围基本一致.

2.2.3 底物浓度对L9降解效率的影响 由图3可知,在OPnEO浓度低于200mg/L时,L9对OPnEO的降解速率随OPnEO初始浓度的增加而迅速下降,变化十分明显.说明混合菌L9在低浓度的OPnEO环境中迅速生长,并能有效利用OPnEO;当OPnEO浓度为200~800mg/L时,L9对OPnEO的降解率受浓度的影响不大,降解率基本保持在50%左右,说明L9能够适应较高OPnEO浓度环境.考虑到L9的实际应用环境和实际应用价值,选择底物浓度为500mg/L作为后续研究;而当OPnEO浓度高于1000mg/L时,L9对OPnEO的降解率又开始出现大幅下降,到1500mg/L时,降解率下降到31.3%.

2.2.4 接种量对L9降解效率的影响 由图4可知,接种量对于L9降解OPnEO的影响比较明显,随着L9接种量的增加,L9对OPnEO的降解率大幅增加,但并不成简单线性关系.当接种量达到4%时,此时L9对OPnEO的降解效果达到最佳,降解率为51.8%.再继续增加接种量, L9的降解效率并没有明显增加,反而有少许下降.

2.2.5 外加碳、氮源对L9降解效率的影响 从图5可知,添加外加碳源对L9降解OPnEO的效果有一定的促进作用,且葡萄糖能有效提高L9对OPnEO的降解,其次蔗糖、麦芽糖和乙酸钠也对L9的降解效果有一定促进作用.而柠檬酸和乳糖的存在则会抑制L9对OPnEO的降解效果,这可能与菌株体内酶活受到影响有关.从图6中可以看出,胰蛋白胨能提高L9对OPnEO的降解能力,且有机氮源对L9降解能力的促进作用均高于无机氮源.

2.3 响应面法优化L9降解性能

2.3.1 PB试验设计结果分析 运用Design- Expert.8.05b软件进行数据处理分析,结果如表3和表4所示.从表3中可以看出,试验组3对OPnEO的降解率最高,达到60.83%;试验组9的降解率最低,仅有11.22%.将试验数据采用Design-Expert.8.05b软件分析后,可得方程为

=40.91+0.972-1.183+4.575-1.596- 6.027-0.888+11.1910

式中,2为葡萄糖含量,%3为OPnEO浓度,mg/L5为L9接种量,%;6为胰蛋白胨含量,%;7为温度,℃;8为培养时间,d;10为初始pH.得到模型的为0.0042,表明所得回归方程显著,即该模型在研究的整个回归区域拟合性很好;复相关系数2=0.9765,表明相关性比较好;校正决定系数Adj2=0.9355,表明93.55%的试验数据的变异性可用此回归模型来解释;通常情况下变化系数(v)越低,试验的精确度和可信度越高,v值等于9.00%,表明此PB试验的精确度和可信度较好;精密度指有效信号和噪声的比值,大于4.0即视为合理,在本试验精密度为16.508,远大于4.0.从回归分析结果表4可知,L9的接种量(L9菌悬液与培养液体积比)、温度以及初始pH值对L9降解OPnEO的效率存在显著影响,其中初始pH的值最小(=0.0005),说明其对L9降解OPnEO的效率影响最显著,其次是温度(=0.0048),再次为L9的接种量(=0.0127).而其他4个因素,葡萄糖浓度、OPnEO浓度、胰蛋白胨浓度以及培养时间的值均大于0.05,对L9降解OPnEO的效率没有明显影响.由此可知,初始pH、温度和L9的接种量为影响L9降解OPnEO效率的关键因素.

表3 Placket-Burman试验设计与结果 Table 3 Design and its response value of Plackett- Burman experiment

注:1~11含义同表1.

表4 Placket-Burman试验分析结果 Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment

注:1~11含义同表1.

2.3.2 最陡爬坡试验结果与分析 根据Placket-Burman 试验筛选出的3个显著因素估计系数的正负效应,依次增大或减小,其他因素根据单因素试验结果分别取最佳值,设计最陡爬坡试验.结果如表5所示,随着L9接种量、初始pH的增加和温度的减小,L9对OPnEO的降解率呈现先增大后减小的趋势.当L9接种量为4%,初始pH为7.0,温度为28℃时,L9对OPnEO的降解效率达到最大.因此,序号3的试验为最大响应值区域,故以此为中心点进行后续响应面分析.

表5 最陡爬坡试验设计及结果 Table 5 Experimental design and results of steepest ascent

2.3.3 响应面分析法确定最佳降解条件 通过最陡爬坡试验确定3个显著因子的最适范围后,以L9接种量4%、温度28℃、初始pH值7.0为中心点实施响应面分析,各因素水平见表6.以OPnEO降解率为响应值,设计3因素3水平的Box-Behnken试验,试验设计及结果见表7和表8.

表6 Box-Behnken 设计因子及水平 Table 6 Factors and levels of Box-Behnken design

运用Design Expert 软件对17个试验点的响应面值进行回归分析,得二次多项式方程

=61.29+0.97+2.03+4.52-0.84+0.33+

0.89-2.812-5.342-9.262

式中:为OPnEO降解率;、、分别为L9接种量、温度、初始pH的编码值.相关系数2= 0.9530,说明方程的拟合度比较好,可以用该方程进行试验结果预测.

表7 Box-Behnken 试验设计及结果 Table 7 Box-Behnken experimental design and result

运用Design-Expert.8.05b软件对该模型进行回归方差分析和显著性检验,得到模型值为0.0007,远小于0.01,表明该模型极显著,即该模型在被研究的整个回归区域拟合性很好;模型的变异系数(v)为4.39%,说明模型的精密度较好,试验的可信度较高.结合响应面分析3维图(图7),可直观的看出各因素之间的交互作用,表明响应值与各因素间并不是简单的线性关系,且响应值存在1极值点.

分析表8数据可知,3个显著因子对响应值的影响排序为:初始pH值()>温度()>L9接种量().其中,、2对的影响差异极显著,、2和2对的影响高度显著,而、、和对的影响不显著.

对模型构建的方程进行偏导微分处理,得到方程的3个解:=4.16,=28.20,=7.13,即:L9接种量4.16%、温度28.20℃、初始pH7.13.此时,L9对OPnEO降解率达到最大预测值,为62.15%.

2.3.4 验证试验 由模型可知,三个显著因素L9接种量4.16%、温度28.20℃、初始pH7.13时,L9对OPnEO降解率达到最大预测值62.15%.为验证模型预测结果的准确性和有效性,按照优化后的OPnEO降解条件进行摇瓶试验,重复试验3次.结果显示,实际检测OPnEO的降解率分别为61.95%、60.81%、61.02%,平均值为61.26%,与预测值62.15%接近,两者之间具有良好的拟合性,表明该模型能比较真实的预测各因素对L9降解OPnEO的影响.同时,与未优化试验组之前结果比较发现,优化后的最佳降解条件可使L9对OPnEO的降解率提高4.82%.

3 讨论

虽然在多数领域中高效混合菌的作用已得到肯定,部分成果也已经在实践中得到应用[27-30],但在降解表面活性剂,特别是OPnEO污染的研究报道尚不多见.故本实验选择在前期已筛选的H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23四株辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)高效降解菌的基础上,采用等比混合的方式构建混合菌.结果发现,混合菌对OPnEO的降解效果并不一定都比单菌株高,甚至有些混合菌比各单菌株的降解率还低,这与何丽媛等[31]的研究结果相一致.由此可见,如果只是简单的把能利用同一底物的单菌株组合在一起,不一定会取得理想的效果.这是由于当前对于具有协同作用关系的混菌筛选还停留在一个随机的过程上,对混合菌体系中各菌间相互关系和作用机理缺乏深入研究,从而不能有效地协调各菌株之间的关系,使其达到最佳水平,发挥最大效应.上述问题都严重地阻碍了混合菌的发展和实际应用.

因此,从生理、代谢和遗传角度深入研究菌株间的关系和协同作用机理,对提高混合菌的稳定性和协同作用效率具有重要作用.在此基础上引入一些新兴的生物技术,如利用细胞融合技术和基因工程技术把具有互利协同关系的微生物构建工程菌,可使其既具有混菌培养的功能,又拥有纯培养菌株营养要求单一、易于调控、生理代谢稳定等优点;采用固定化微生物技术固定高效优势混合菌,以使其可多次重复使用,降低成本,增加效率,提高环境耐受能力,这些都对混合菌的理论发展和实际应用有重要意义.

4 结论

4.1 通过对四菌株(H1、TXBc10、OPQb11和TXBa23)进行等比例组合实验,获得了一组高效降解OPnEO的混合菌L9(H1:TXBc10:TXBa23= 1:1:1),其在总接种量4%,28℃,pH7.0,180r/min培养7d对初始浓度为500mg/L的OPnEO降解率达到56.44%,比降解效果最好的单一菌株(表1试验组15TXBa23,47.81%)提高了8.63%.

4.2 运用单因素试验考察了影响混合菌L9降解的相关因素,初步确定混合菌L9降解OPnEO的最适外加碳源和氮源分别是葡萄糖和胰蛋白胨,最适pH值7.0,最适温度28℃,最适接种量4%.应用响应面法分析,确定混合菌L9的最优降解条件为50mL反应体系中接种量4.16%、温度28.20℃、初始pH值7.13、葡萄糖浓度2%、胰蛋白胨浓度2%、OPnEO初始浓度500mg/L、180r/min培养7d,该条件下混合菌L9对OPnEO的降解率达62.15%,通过验证实验实际检测的平均值为61.26%,比未优化条件下提高了4.82%.

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* 责任作者, 副教授, 1227677453@qq.com

Construction of mixed flora effective degrading octylphenyl polyethoxylates (OPnEO) and optimization of degrading conditions using response surface method

LIU Wen-bin, ZHANG Hai-tao, YANG Hai-jun*, LIU Ya-bin, XU Yun-hai

(College of Plant Protection ,Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)., 2016,36(8)：2444~2452

In order to heighten the biodegradation effect of the non-ionic surfactant octyl phenol ethoxylates (Octylphenyl polyethoxylates, OPnEO) in the laboratory, four mixed degradation bacteria (H1, TXBc10, OPQb11, TXBa23) were screened to degrade OPnEO. The construction of OPnEO mixed flora centers on the degradation effects of four bacterial strain of different ratios on OPnEO. The degradation rate of hybrid strain L9 (H1: TXBc10: TXBa23 1: 1: 1) to OPnEO reached 56.44% (highest), slightly higher than the degradation effect of each single strain. The factors related to degradation efficiency of L9were optimized as follows: optimum carbon and nitrogen sources were sucrose and tryptone, respectively; optimum initial pH value was 7.0, the optimum temperature was 28℃; optimum inoculation amount was 4%. To further the degradation rate, three significant factors affecting the degradation OPnEO were screened in Plackett-Burman experimental design: L9mixed bacteria inoculation, temperature, and initial pH value. Then steepest ascent approached the maximum response area of the three significant factors. Using Box-Behnken experimental design and response surface analysis, the optimal conditions for the degradation of OPnEO by mixed bacteria L9were confirmed as follows: inoculation 4.16%, temperature 28.20℃, initial pH value 7.13, sucrose concentration 500mg/L, tryptone concentration 500mg/L, OPnEO initial concentration of 500mg/L,180r/min cultured 7d. Under these conditions, the degradation rate of OPnEO by L9reached 62.15%, about 5% higher than non-optimized OPnEO of experimental conditions. These results can effectively solve the current problem of environmental pollution such as tanning, washing, pesticides and other industries caused by OPnEO, and will offer new ideas to the study of other types of biodegradable surfactants pollutants.

octylphenyl polyethoxylates (OPnEO)；mixed flora；response surface methodology；biodegradation

X172

A

1000-6923(2016)08-2444-09

刘文斌(1990-),男,湖南益阳人,湖南农业大学微生物学专业硕士研究生,主要研究方向为环境污染与治理.

2016-01-18

湖南省自然科学基金(2015JJ2079);长沙市科技计划(K1403022-31)