电针对阿尔茨海默病大鼠海马谷氨酸受体相互作用蛋白1、2表达的影响①

刘若兰，沈　沉，沈晓燕，田　峻

电针对阿尔茨海默病大鼠海马谷氨酸受体相互作用蛋白1、2表达的影响①

刘若兰1，沈沉2，沈晓燕3，田峻1

目的探讨电针对Aβ25-35所致的阿尔茨海默病（AD）模型大鼠海马神经元突触后膜α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙（AMPA）受体相关蛋白谷氨酸受体相互作用蛋白（GRIP）1、GRIP2表达的影响。方法40只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组，每组10只。采用海马CA1区注射寡聚态Aβ25-35制备模型，假手术组在相同部位用同样方法注射等量的生理盐水。造模成功后第2天开始，电针组选取双侧肾俞、百会穴进行治疗，每天1次，每周6次，共2周。治疗结束后行免疫组化检测GRIP1、GRIP2的表达量。结果正常组与假手术组GRIP1、GRIP2蛋白表达无显著性差异（t＜1.7438，P＞0.05）。与假手术组比较，模型组、电针组GRIP1、GRIP2蛋白表达显著下降（t＞9.5928，P＜0.001）。与模型组比较，电针组大鼠GRIP1、GRIP2蛋白表达升高（t＞9.5326，P＜0.05）。结论电针可能通过增加与AMPA受体定位插入相关的突触后蛋白GRIP1、GRIP2的数量，使突触后膜上的AMPA受体数量增多。

阿尔茨海默病；电针；谷氨酸受体相互作用蛋白；大鼠

［本文著录格式］刘若兰，沈沉，沈晓燕，等.电针对阿尔茨海默病大鼠海马谷氨酸受体相互作用蛋白1、2表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（4）：413-416.

CITED AS：Liu RL，Shen C，Shen XY，et al.Effects of electroacupuncture on expression of glutamate receptor interacting proteins 1 and 2 in hippocampus of rats withAlzheimer's disease［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：413-416.

1　材料与方法

1.1实验动物和分组

健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，SPF级，体质量（250±20）g，由湖北省实验动物研究中心提供。饲养环境温度21～25℃，湿度40%～60%，自由进食饮水。

实验动物适应性喂养1周后，无不良反应，饮食、饮水正常，即开始进行Y型水迷宫筛选［4］，淘汰反应特别敏感或过于迟钝的大鼠，将通过的40只大鼠按随机数字表法分为正常组、假手术组、模型组和电针组，每组10只。实验中被剔除或死亡者均在后续实验中予以补齐。

1.2试剂及仪器

MT-200 Morris水迷宫视频跟踪系统：成都泰盟。Y型水迷宫：中国医学科学院药物所。89-00136颅脑立体定位仪：国营西北光学仪器厂。G6805-Ⅱ型电针治疗仪：上海医疗器械厂。Aβ25-35：美国SIGMA公司。GRIP1、GRIP2试剂盒：湖北谷歌生物科技有限公司。

1.3实验试剂制备

按试剂说明，将Aβ25-35单体0.1 mg用二甲基亚砜50 μl溶解后，再加入0.1 mol/L的PBS（磷酸盐缓冲液）50 μl稀释配制成1 mg/μl的溶液，37℃水浴箱孵育1周，使其变成寡聚状态而具有神经毒性，-20℃分装保存。

1.4动物模型制备

10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射大鼠麻醉后，固定于颅脑立体定位仪。手术区备皮，参照大鼠脑立体定位图谱［5］，在前囟后3.3 mm、中线旁开1.5 mm定位。用牙科钻钻出进样孔。将5µl微量注射器垂直插入颅骨表面进针3.0 mm至海马CA1区，将Aβ25-35按1.0 μl/min速度缓慢注入双侧海马，5 min内注射完毕，留针5 min，缓慢出针，防止Aβ25-35溢出。义齿基托树脂封闭进样孔，最后缝合大鼠头部切口。肌注青霉素G 10万U防止感染，持续3 d。假手术组于颅内注射等量生理盐水，电针组同模型组。造模后再次行“Y”型水迷宫筛选，15次测试中正确次数较造模前下降1/3以上者为造模成功。

1.5方法

造模成功后第2天，根据大鼠穴位定位方法［6］，选用30号1寸华佗牌毫针，电针组在大鼠百会向后斜刺4 mm，双侧肾俞直刺5 mm，针刺后接G6805-Ⅱ型电针治疗仪，百会连耳尖，双侧肾俞连一对电极，施以频率2 Hz，电流强度1 mA连续波，持续20 min。每天1次，每周6 d，共治疗2周。

正常组、假手术组和模型组仅在对电针组大鼠行电刺激时给予同样的抓取和固定动作。

1.6标本处理与指标检测

电针治疗结束后第2天，大鼠用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉成功后，4%多聚甲醛心脏灌注固定取样，放入4%多聚甲醛溶液中固定。石蜡包埋、切片，片厚4 μm，免疫组织化学法检测GRIP1、GRIP2的表达。步骤如下：切片脱蜡后PBS清洗，加入0.3%过氧化氢甲醇溶液室温孵育30 min；加入0.3%Triton X100溶液室温孵育30 min；加入100倍PBS溶液稀释一抗，4℃孵育过夜；吸去抗体；加入二抗，室温孵育2 h。加入ABC复合物（A.DAB；B. H2O2；3.磷酸缓冲液），室温孵育2 h；蒸馏水冲洗；加入显色液，脱水、透明、封片。

应用Image-Pro Plus6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值（IOD）。

1.7统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。每组10张照片，实验数据以（x¯±s）表示，数据比较采用t检验。显著性水平α=0.05。

2　结果

正常组与假手术组GRIP1、GRIP2蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。与假手术组比较，模型组、电针组GRIP1、GRIP2蛋白表达显著下降（P＜0.001）。与模型组比较，电针组大鼠GRIP1、GRIP2蛋白表达升高（P＜0.05）。见表1、图1、图2。

表1　各组大鼠海马区GRIP1、GRIP2表达（IOD）

3　讨论

中医学认为痴呆的发生与五脏虚衰相关，其病变在脑，而肾不藏精是本病的发病基础。脑为髓海，肾藏精、主骨、生髓。因此脑髓是否充盈受肾之精气的盛衰的影响，肾精充足则脑髓充盈，大脑思维、认知正常发挥。反之肾中精气不足，则脑失所养，大脑智力减退，出现痴呆。故治疗以补肾填髓，健脑益智为主。通过文献检索发现，在针灸治疗AD的实验动物选穴中，百会与肾俞是最为常用的穴位［7］。百会穴位于督脉与补脑髓密切相关，具有醒脑开窍，益智调督的作用。经临床和实验证实，本穴具有保护大脑组织，改善脑血液供应，增强记忆力等方面的功效，对于精神意志障碍等症状均有一定的疗效［8］。肾俞穴，特定穴之背俞穴，属于膀胱足太阳之经，肾中精气汇集并转输于背腰部的腧穴，通达全身阳气。本穴能补肾填精，强腰健脑。通过电针刺激百会穴和肾俞穴而达到标本同治AD的目的。

突触是神经元之间信息传递的关键部位，是神经元可塑性的结构基础。在中枢神经系统中，兴奋性突触传递的长时程增强（long-term potentiation，LTP）和长时程抑制（long-term depression，LTD）反映突触传递效能的持久变化，是研究学习记忆机制的重要模型。AMPA受体是存在于突触后膜上由GluR1～4组成的异聚体，脑内AMPA受体的常见组合形式是GluR1/ GluR2和GluR2/GluR3。作为兴奋性离子型谷氨酸受体，AMPA受体在中枢神经系统的快速兴奋性突触传递起重要作用，影响学习与记忆功能［9-10］。AMPA受体的表达和分布异常可能使突触可塑性受损，引发认知障碍［11］。

图1　各组大鼠海马CA1区GRIP1表达（200×）

图2　各组大鼠海马CA1区GRIP2表达（200×）

AMPA受体并不是稳定地存在于突触后膜上，而是随着神经活动不断地在细胞膜与细胞质间进行循环，即不断地移入（插膜）或移出（内化）突触后膜使其在突触后膜的数量和密度不断变化［12］。而突触后膜上AMPA受体的数量决定了突触后神经元兴奋的程度，是中枢神经系统影响突触可塑性的主要决定因素［13］。

AMPA受体的插膜过程需要几个受体反应蛋白来完成，GRIP在其中起重要作用。它是Dong等研究发现的一类含有7个PDZ结构域的蛋白质，包括GRIP1和GRIP2，通过与AMPA受体亚基GluR2及GluR3的C末端相互作用，调节AMPA受体亚基在细胞膜与突触后膜上的分布，从而稳定AMPA受体在突触后膜的聚集分布，调节突触的可塑性［14-15］。研究表明GRIP1的分布与GluR2/3在大脑中的分布状态相似［16］，在大脑及海马有GRIP1与AMPA受体的共存。GRIP1与GluR2免疫双标显示，二者在胞体及大部分的树突有广泛的交叠现象，证明GRIP1可能在兴奋性突触AMPA受体的聚集与功能调节中有一定的作用［17-18］。变异型GluR2因不能与GRIP结合而使突触后膜的AMPA受体数量下降，提示含有GluR2亚基的AMPA受体在突触后膜的表达依赖于GRIP-GluR2的相互作用。

针灸具有疏通经络、调理脏腑、平衡阴阳的作用，且操作简便、经济实用。大量的临床和实验研究表明针灸对AD的学习记忆能力有明显的改善作用［19-20］。本实验结果显示，模型组大鼠海马神经元蛋白AMPA受体相关蛋白GRIP1、GRIP2表达显著减少（P＜0.001），电针组蛋白表达较模型组增多（P＜0.05）。电针治疗后，正常组和假手术组突触后膜表达蛋白GRIP1、GRIP2含量变化无显著性差异（P＞0.05），而假手术组与电针组和模型组之间有非常高度显著性差异（P＜0.001），说明电针可能通过增加GRIP的表达量从而提高GluR1和GluR2在细胞膜表面以及突触中的表达，从而增强AMPA的突触传导［21］，使AMPA受体能被运送至突触部位并抵抗胞吞作用而稳定表达于突触后膜，从而发挥调节突触可塑性的作用，对学习记忆能力起到了一定的改善作用［22］。下一步，我们可对AMPA受体进行阻滞，进一步观察电针对AD模型大鼠神经元突触可塑性的调节作用，观察电针是否仅通过或主要通过影响AMPA受体及其效应相关蛋白的表达，调节神经元突触可塑性，从而发挥治疗AD的作用。

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Effects of Electroacupuncture on Expression of Glutamate Receptor Interacting Proteins 1 and 2 in Hippocampus of Rats withAlzheimer's Disease

LIU Ruo-lan1，SHEN Chen2，SHEN Xiao-yan3，TIAN Jun1
1.Rehabilitation Department，Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan，Hubei 430071，China；2.Department of Acupuncture and Moxibustion，Hubei Provincial Hospital of TCM，Wuhan，Hubei 430061，China；3.Wuhan University，Wuhan，Hubei 430071，China
Correspondence to TIAN Jun.E-mail：18995540980@126.com

Objective To investigate the effect of electroacupuncture on the expression of α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole propionate（AMPA）receptor associated protein glutamate receptor interacting protein（GRIP）1 and GRIP2 in hippocampal neurons of rats with Alzheimer's disease（AD）model induced by Aβ25-35.Methods 40 Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group，sham operation group，model group and electroacupuncture group with 10 rats in each group.The AD rat model was prepared by injecting Aβ25-35in the hippocampus CA1 of rats，while the sham operation group was injected with equal amount of normal saline at the same location.On the second day after successful modeling，the electroacupuncture group received electroacupuncture at Baihui（DU20）and bilateral Shenshu（BL23）acupoints，once a day，6 times a week for 2 weeks.The expression of GRIP1 and GRIP2 were detected with immunohistochemistry.Results There was no difference in the expression of GRIP2 and GRIP1 proteins in hippocampus between the normal group and sham operation group（t＜1.7438，P＞0.05），but was lower in the model group and the electroacupuncture group than in the sham operation group（t＞9.5928，P＜0.001），and was higher in the electroacupuncture group than in the model group（t＞9.5326，P＜0.05）.Conclusion Electroacupuncture may increase the number ofAMPAreceptors on the postsynaptic membrane by increasing GRIP1 and GRIP2.

Alzheimer's disease；electroacupuncture；glutamate receptor interacting protein；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.009

R749.1

A

1006-9771（2016）04-0413-04

湖北省自然科学基金面上项目（No.2012FFA095）。

1.武汉大学中南医院康复科，湖北武汉市430071；2.湖北省中医院针灸科，湖北武汉市430061；3.武汉大学，湖北武汉市430071。作者简介：刘若兰（1985-），女，汉族，湖北襄阳市人，硕士，医师，主要研究方向：针灸防治脑病。通讯作者：田峻（1968-），男，汉族，湖北武汉市人，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：中西医结合康复治疗骨关节病。E-mail：18995540980@126.com。

随着人口老龄化呈逐年上升趋势［1］，阿尔茨海默病（Alzheime's disease，AD）患病人群也逐渐增多，已严重影响国民的健康和生活质量。它的临床最主要首发症状是学习记忆障碍，而神经元的突触可塑性改变是被公认的学习记忆的机制［2］。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙（α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole propionate，AMPA）受体是调节突触可塑性的重要靶点，它是存在于中枢神经系统突触后膜上的一种离子型谷氨酸受体，其在突触后膜的定位插入是静寂突触转化为功能突触的必要环节［3］。AMPA受体在突触后膜的锚定需要几种突触后蛋白的参与，谷氨酸受体相互作用蛋白（glutamate receptor interacting protein，GRIP）在其中起重要作用。已有大量基础和临床研究表明针刺治疗可以促进学习记忆能力的改善，但针刺对突触后与AMPA受体结合的膜蛋白的影响尚未见报道。本实验通过观察电针对大鼠学习记忆能力及GRIP表达的影响，探讨电针对AD的防治作用及机制。?

（2015-09-21

2016-02-03）