人工合成色素亮黑标准样品的研制

郑新华　韩焕美　何桂华　张爱霞　王　乐　陈　晞

(济南出入境检验检疫局，济南 250014)



人工合成色素亮黑标准样品的研制

郑新华韩焕美何桂华张爱霞王乐陈晞

(济南出入境检验检疫局，济南 250014)

建立了人工合成色素亮黑标准样品的制备方法。采用凝胶色谱法纯化亮黑原料：将亮黑粗品溶于水中，加入硅藻土助滤剂搅拌后过滤，滤液加入凝胶柱；以纯水冲洗凝胶柱，分离出杂质；收集主色素组分；蒸发水分，浓缩后溶液过滤；滤液再加入无水乙醇沉降产物，再次过滤，室温真空干燥，得到亮黑高纯样品。通过核磁共振(1H NMR谱、13CNMR谱)、红外光谱和液相色谱-质谱对亮黑纯品进行定性分析，利用高效液相色谱面积归一化法进行纯度定值，亮黑纯度为98.66%，满足标准样品的要求。

亮黑标准样品合成色素

人工合成着色剂因其色泽鲜艳、着色力强、性质稳定、价格低廉，成为食品工业常用的添加剂之一。其主要是以苯、甲苯、萘等芳烃类化工产品为原料，经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等一系列有机反应化合而成[1]。亮黑是人工合成着色剂的一种，常被作为食用黑色色素。目前我国多种合成着色剂包括亮黑还没有标准样品，均是依靠国外进口。而标准样品可以用来校准仪器、评价测量方法和给材料赋值，是产品质量控制和保证结果准确度的重要溯源标准[2-6]。

本文报道了亮黑标准物质的研制方法，对完善我国国家标准技术体系建设、加强食品安全质量控制具有重要意义。

1　实验部分

1.1试剂材料与仪器设备

Agilent1260液相色谱仪配二极管阵列检测器(美国安捷伦公司)；TSQ quantum ultra液相色谱-串联质谱仪(美国Thermo公司)；Bruker AV400核磁共振仪(德国，Bruker公司)；感量为0. 1 mg的分析天平(瑞士梅特勒公司)；Milli-Q 纯水器(美国Millipore公司)；IKA-KS130型振荡器(德国IK公司)；甲醇(色谱纯，默克公司)；冰乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；超纯水由Milli-Q 纯水器制备；亮黑购于上海化工三厂。其他试剂，如非提及均为分析纯。

1.2液相色谱检测条件

高效液相色谱仪(安捷伦1260)，配二极管阵列检测器；Agela Technologies Venusil XBP C18(L)色谱柱：(4.6mm×150mm，5μm, 150Å,)或相当者；流动相A：20mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B：甲醇，流动相根据不同时间采取梯度洗脱见表1；流速为1.0mL/min；柱温：室温；进样量：10μL；检测波长：570nm，流动相梯度洗脱条件见表1。

表1　液相色谱流动相梯度洗脱条件

1.3液相色谱-质谱检测条件

色谱条件：样品用甲醇溶解，浓度为1.0 μg/mL；色谱柱：Thermo Hypersil GOLD(2.1mm×100mm)；流速为0.3mL/min；柱温为室温；进样量5μL。

质谱条件：使用Thermo Xcalibur数据处理系统；ESI源：负离子检测；扫描范围：m/z 250～800；柱后分流比：3∶1；鞘气流：40 arb；辅助气流：10arb；源电压3.20kV；毛细管温度：350℃；毛细管电压-3.5kV。

1.4核磁共振成像检测

所有样品的核磁谱图均是在Bruker AV400上完成，溶剂是氘代二甲亚砜。

1.5红外光谱检测

傅立叶变换红外光谱在Bruker V80光谱仪上完成。样品以KBr样品压片后直接粘附在样品架上，每个谱图扫描32次，分辨率为4cm-1，背景谱图是空气，红外光谱采用透射模式。

1.6紫外可见光谱检测

紫外-可见光谱用Shimadzu UV-3100 UV-VIS-NIR分光光度计测定。

2　结果与分析

2.1纯化条件选择

亮黑色素是人工合成色素，合成时产生的主要杂质为未磺化芳族伯胺和未反应原料，分子量较主成分小，以及少许分子量较大的副色素，故可以采用凝胶色谱法分离。用硅胶装填凝胶色谱柱(容量800mL)，以水冲洗凝胶色谱柱备用；称取亮黑粗品2.0g，溶于20mL水中，超声溶解；加入助滤剂硅藻土，搅拌15min后过滤；滤液加入凝胶柱；以纯水冲洗凝胶柱，前期分出少许副色素；收集主色素组分；减压蒸出水分，溶液浓缩至约20mL，过滤；滤液加入无水乙醇，产物沉降；过滤，以乙醇洗涤；室温真空干燥，得到纯品亮黑，结构式见图1。

2.2定性分析

对制备的纯品通过核磁共振、红外光谱和液相色谱-质谱进行定性分析，图2～图4分别是亮黑的核磁共振谱图、红外光谱图和液相色谱-质谱图。分析亮黑1HNMR数据如下: δ3.34(3H,s)、δ17.32(—NH,s)、δ7.87(1H,d)、δ8.16(1H,d)、δ7.85(1H,s)、δ8.06(1H,d)、δ8.09(1H,d)、δ8.18(1H,d)、δ8.62(1H,d)、δ9.06(1H,d)、δ8.79(1H,s)、δ8.35(1H,d)、δ8.79(1H,s)、δ8.37(1H,d)；其13CNMR数据如下：δ26.23、δ169.74、δ142.52、δ116.13、δ127.33、δ134.31、δ132.02、δ114.18、δ140.64、δ134.07、δ147.43、δ113.43、δ150.87、δ126.40、δ142.52、δ126.40、δ131.43、δ127.33、δ150.87、δ123.01、δ123.01、δ152.99、δ123.01、δ127.33、δ144.51、δ123.01、δ127.33。图3给出了亮黑的红外光谱特征吸收峰3436、1696、1580、1549、1494、1316、1194、915、827、706、680、648cm-1，与文献报道吻合良好。图4中是亮黑液相色谱-质谱的总离子流图和一级质谱图，出峰时间6.24min，扫出质荷比为410.52的[M-2Na]2-离子峰、266.12的[M-3Na]3-离子峰、258.76的[M-4Na+H]3-离子峰，通过以上数据可以定性亮黑。

2.3定值分析

2.3.1紫外可见光谱测定

将制备好的亮黑纯品配制成浓度为20μg/mL的甲醇溶液，用紫外可见光谱进行全波长扫描，从图5可以看出，靛蓝在波长315nm、410nm和570nm处有特征吸收，其中570nm吸收值最强，因此，液相色谱定值分析选择570nm。

2.3.2液相色谱分析

采用凝胶色谱技术对市售亮黑原料纯化，制得亮黑纯品。通过核磁共振(1H NMR谱、13CNMR谱)、红外光谱和液相色谱-质谱对靛蓝纯品进行定性分析，利用高效液相色谱法面积归一化法进行纯度定值，靛蓝纯度为98.66% ，满足标准样品的要求，为产品质量控制、检测方法验证和保证实验室测量结果的准确可靠与互认建立了溯源标准。

[1]王惠琴，郑大威，林太凤，等. 食用色素在食品中的应用及检测方法研究进展[J]. 食品工程, 2009, 4:3-5.

[2] GB2760-2011《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[S]．

[3]韩永志. 标准物质的定值[J].化学分析计量, 2001,10(5)：38-39.

[4]钱耆生．分析测试质量保证[M]. 大连:辽宁大学出版社, 2004: 576-578.

[5] ISO Guide 35，2006． Reference Materials-General and Statistical Principles for Certification． Guide for International Organization for Standardization(ISO) [S]．

[6] Stolker A A M, Brinkman U A Th. Analytical strategies for residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents in food-producing animals-a review[J]. J Chromatogr A, 2005, 1067(1): 15-53.

Preparation and certification of reference sample of brilliant black derived from edible synthetic colorant.

Zheng Xinhua, Han Huanmei,He Guihua, Zhang Aixia, Wang Le, Chen Xi

(JinanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Jinan250014，China)

Brilliant black on sale was purified by gel chromatography technology. After the qualitative analysis of high pure brilliant black by1HNMR spectrum,13CNMR spectrum, infrared spectrum and liquid chromatography/mass spectrometry, the purity of brilliant black was certified by high performance liquid chromatography，the purity was 98.66%.

brilliant black; reference sample; synthetic colorant

国家质检总局课题(课题编号2012IK178)；山东出入境检验检疫局课题(SK201424)。

郑新华，女，1971年出生，高级工程师，本科，主要从事食品检测研究，E-mail：2413668938@qq.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.016

2015-09-21