LC-NMR联用技术的研究进展

吴春红

(中国石油化工股份有限公司北京化工研究院燕山分院，橡塑新型材料合成国家工程研究中心，北京 102500)



综述

LC-NMR联用技术的研究进展

吴春红

(中国石油化工股份有限公司北京化工研究院燕山分院，橡塑新型材料合成国家工程研究中心，北京 102500)

本文从NMR的灵敏度，溶剂的相容性、溶剂谱峰的抑制、联用仪器NMR探头的设计、LC-NMR操作模式等方面对LC-NMR联用仪器的发展过程进行了较为详细的介绍，并依托文献的研究实例对连续流(continuous flow)方式和驻流(stopped flow)方式两种操作模式进行了对比分析。

LC-NMR联用连续流驻流

1　引言

最近的几十年，应用与分离技术相关的仪器联用技术进行复杂基体的定性和定量分析发展很快。分离技术中高效液相色谱(HPLC)是分析复杂有机物、药物和生物大分子等混合物的一种重要手段，近年来相关技术的发展实现了高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用的实际应用，但MS本身并不能够提供清晰的分子结构信息，而且在实际HPLC-MS的使用中，常常需要核磁共振(NMR)的数据。随着近年来NMR仪器灵敏度的不断提高，HPLC与NMR直接相连已经成为可能，HPLC与MS或NMR的物理连接增强了解决未知化合物结构问题的能力[1，2]。 20世纪70年代末，第一次有人将HPLC-NMR联用，由于技术方面的原因，直到80年代末HPLC-NMR技术才作为一种有效的分析手段而得到了承认。最近几年HPLC-NMR的分析方法迅速发展并取得了巨大的成功，已经被证明为生物化学和药物化学分析中最重要的分子结构鉴定方法之一[3]。

1978年，第一篇关于LC-NMR联用的文章问世，采用驻流操作的方法分析了一个含有两至三个已知化合物的混合物，那时，NMR方面的局限比较严重，主要是NMR溶剂、软件、硬件以及只有在旋转状态才能得到较高分辨率的谱图，使得NMR直接与HPLC联用比较困难[4]。M.V. Silva Elipe[5]曾经使用四氯乙烯或四氯化碳作溶剂，ETH-Silia作为正相柱进行过联用实验，但由于当时溶剂峰抑制技术的欠缺，使得他只能将精力集中在NMR的软件、硬件以及色谱上使用反相柱等来拓展联用技术的应用范围。LC-NMR联用技术采用反相色谱柱，使得这个技术更复杂，这是因为：(1)使用多于一种的含质子溶剂，会严重干扰样品的分析；(2)如果使用梯度柱，在色谱运行过程中，溶剂在发生变化；(3)分析物质的信号强度与溶剂的信号强度相比太小。1995年，Smallcombedeng[6]克服了上述困难，发展了溶剂抑制技术，大大改善了流动和驻流模式LC-NMR技术的谱图质量。WET(T1效应水峰抑制技术)优化抑制溶剂产生了高质量的1D谱以及2D谱，采用的两维谱技术有WET-TOCSY，WET-COSY，WET-NOESY等。

2　LC-NMR

到底是使用NMR还是LC-NMR来分析混合物，取决于色谱分离能力以及NMR的结构分析能力，LC-NMR主要考虑的技术细节是NMR的灵敏度，溶剂的相容性、溶剂的抑制、NMR探头的设计、色谱峰以及NMR流动池的体积。采用Bruker公司的核磁共振谱仪的LC-NMR联用仪器构造示意图[7]如图1。

2.1NMR灵敏度

相对于MS来说，NMR是一个不灵敏的分析方法，MS分析的检出限在皮克(pg)数量级，而现代高场NMR谱仪(400MHz或更高)能检测得到的信号为纳克量级(MW300)。对于结构分析来说，亚毫克量级可以较好地解决，样品量的下限一般是在几百纳克左右。采用超低温探头技术，NMR的灵敏度可以大大改善，可以检测到几纳克量级的样品信号。因为质子的高灵敏度、高丰度，以及有机化合物中普遍存在的特点，使得质子是NMR分析中最广泛使用的原子核；相对而言，C-13作为有机化合物的基本骨架结构使它成为另一个较主要的核，但由于其天然丰度较低(1.108%)，只有在目前仪器改进了灵敏度的情况下才成为了一个常规分析的原子核。F-19，自然界中100%的丰度，但使用相对较少，因为只有大约10%的药物使用含氟的化合物。NMR所能测试的原子核的种类很多，凡是具有核磁矩的原子核都可以进行测试。

在做NMR谱的时候，信号需要累加的时间取决于样品量和所测试核的种类，为了获得较好的信噪比，对于1～10μg的样品量，一般累加过夜是很正常的。

2.2NMR和色谱相容的溶剂

液体NMR需要氘代试剂，一般将溶剂放置在5mm或3mm的样品管中，容积相当于500μL或150μL，HPLC需要大量的溶剂，这必然大大增加运行成本，D2O是最便宜的氘代试剂，但是价格超过300美元/升；氘代乙氰(CD3CN)的价格取决于D2O的含量，但是也超过1000美元/升。氘代甲醇则更贵，因此使用氘代试剂作为正相溶剂根本承受不了高昂的价格，这就必然要采用反相柱。另外我们必须要考虑的是HPLC梯度柱与NMR操作的相容性，HPLC梯度柱中由于溶剂的相互混和引起磁场的不均匀性大于2～3%/分钟。

2.3HPLC高浓度溶剂导致的NMR信号抑制

由于LC-NMR运行过程中，溶剂峰的信号强度要大大高于样品的信号峰强度，我们必须压制溶剂峰的强度，即使采用氘代试剂，我们也必须抑制溶剂峰。以乙氰为例，CH3或CD3的C-13的两个卫星峰强度要高于样品的信号峰强度。WET溶剂峰抑制技术[8]自1995年开发以来，大大改善了LC-NMR谱的质量，而且WET溶剂压制技术成为一种常规技术。WET溶剂抑制技术是LC-NMR的标准技术，因为相对与其他抑制技术如预饱和或WATERGATE技术，WET技术有能力同时抑制几个溶剂峰，而基线又不受太大的影响；其缺点就是：在溶剂峰附近的样品峰的强度也会受到相应的影响，导致结构信息的丢失。

2.4NMR流动探头设计

常规NMR流动池的设计，有效体积为60μL (相当于接收线圈的长度)，整个流动池的体积为120μL，这就意味NMR只能“看”60μL的色谱峰，假定HPLC的流动速率为1mL/min，采用4.6mm的柱子，那么只有3.6s的色谱峰能被NMR检测到，而色谱峰宽一般来说要宽于4s，这是LC-NMR与常规的3mm NMR探头相比明显的缺陷，常规探头与色谱峰的宽度是无关的。

2.5 LC-NMR灵敏度

由于NMR是一个低灵敏的技术，需要的样品量在几个mg范围，HPLC如果注入如此多的样品量的话，HPLC柱子会饱和，这将影响色谱的分辨率和分离效果；另一个影响色谱性能的因素是氘代溶剂，因为一般情况下，采用氘代溶剂会使得色谱峰加宽，偶然情况下色谱峰的保留时间还会改变，这是应该改进色谱技术来得到可靠的分辨率的原因，方法之一是降低流速到低于1mL/min来增加LC-NMR的灵敏度，这种情况下，大部分的色谱峰能被NMR看到；但无论如何，上述情况只有在LC体系的泵在低于1mL/min的流速下可以精准控制时才能实施。

2.6LC-NMR操作模式

HPLC与NMR的连接是通过红色的聚醚酮(PEEK)，由于超屏蔽NMR磁体的屏蔽效应，HPLC与磁体的距离可以短至30～50cm，常规磁体，HPLC与NMR磁体的距离在1.5～2m之间。联用时一般使用UV检测器来监测HPLC的运行，放射性或者荧光检测器也可以用来检测感兴趣的色谱峰。目前HPLC-NMR的主要操作方式：连续流(continuous flow)方式和驻流(stopped flow)方式，其中驻流方式又分为3种：时间分割(time-sliced)驻流方式、脱机驻流方式和UV-检测器自动控制NMR取样方式。

2.6.1 连续流模式

在HPLC-NMR所使用的操作模式中，连续流方式是最简单的一种。在连续流操作中，HPLC的流动是连续的，不受NMR 进样的影响，当每一组分由HPLC流经NMR检测池时仪器就会扫描出这个组分的谱图。使用这种方法可以在很短的时间内完成样品的分析并得到各组分分子结构方面的信息。因此连续流操作方式在一些要求较快得出检测结果的分析中得到了应用。连续流NMR探头的几何结构[7]如图2所示。

Siderman等[8]在1996年首次报道了使用750MHz HPLC-1H NMR采用连续流操作方式进行同分异构体分析，分离2-，3-，4-，氯苯酸葡萄糖苷酸取得了非常理想的效果。Godejohann[9]通过实验证明了HPLC-NMR的连续流操作方法在某些实际分析中有良好的定量性能，报道中使用了两种定量方法来分析环境样品中的硝基爆炸残余物。分析结果表明标准偏差在mg级不超过2%，在检测限附近小于40%，完全可以满足环保定量分析的要求。但是，连续流操作方式在应用上有诸多的限制：首先只能检测出1H和19F的NMR谱，而目前在生物化学和药化研究中很多情况下需要用到31P谱的信息；其次若在操作中HPLC采取梯度流出的方式，则NMR溶剂峰位置会随溶剂组成而变化，这样必须准确知道不同组成溶剂峰的位置才能有效地抑制溶剂的NMR信号；再次是流动或连续流动需要更多的样品量来在线检测，因为样品在NMR探头中的停留时间很短，在流动速率为1mL/min时停留时间仅为3.6s，这种方式决定了只能收集NMR一维谱，而且只能分析混合物中的含量较高的组分，使用连续流方式不能够对待测组分作NMR二维谱，使结构信息的获得受到了很大的限制。由于以上的缺陷，连续流操作方式在很多情况下不能满足当今分析研究的需要。

2.6.2驻流模式

如果待测组分的保留时间已知或可用UV、MS等检测器有效地检测到色谱峰的存在，则可以使用驻流操作模式。在驻流操作中，NMR不再随着色谱的连续流动对各个峰进行即时扫描，而是通过不同方式对样品中各组分(或感兴趣的组分)进行单个的、较长时间的扫描。目前较常用的驻流方式主要分为三类：时间分割(time-sliced)驻流方式、脱机驻流方式和UV-检测器自动控制NMR取样方式。

驻流模式需要进行延迟时间的校正，所谓的延迟时间就是样品从UV检测器到NMR流动池(探头)的时间，当然延迟时间受到流动速率以及连接HPLC和NMR流动池的距离的影响。一旦色谱峰进入流动池，色谱即暂停工作，这种方式可以使用更少的样品量，而且还能作2D-NMR实验，如WET-COSY,WET-TOCSY以及其他，这种模式样品可以在NMR探头中停留几天；短时间或色谱峰较少的情况下，可以得到一系列色谱峰的详细信息，而不会发生色谱柱的扩散以及降低色谱的分辨率(要求在2小时内完成NMR实验)。如果采用低温探头，还能进一步提供灵敏度。

R. Singh[10]使用LC-NMR应用驻流流动模式进行了下面的化合物在狗和老鼠的尿液代谢产物中的研究(图3)。

他们所采用的实验条件是梯度柱5～75% B，0～25min，75～95% B， 25～35min， A：D2O， B：ACN(乙腈)，1mL/min, 235nm, BDS Hypersil C18柱，15cm × 4.6cm, 5μm,即使使用非氘代的乙腈，也能得到较好的NMR峰。

图4是狗的胆汁和狗的尿液的UV检测色谱图，M9保留时间为10min，M11保留时间为21min。M11代谢产物也可以在老鼠的尿中发现。为了利用NMR分析M9和M11的结构，采用驻流方式，加大注射量，M9的1H- NMR谱(Varian Inova500MHz，带H-C梯度场反相探头，流动池体积60ul)显示1,2,4-三取代苯环存在。

图5是利用溶剂抑制技术对目标化合物进行的核磁共振氢谱的测试，但由于溶剂抑制技术效果不理想，他们应用LC-NMR联用技术进行的目标化合物的代谢产物实验不是很成功。于是分别收集样品，在Varian Unity 400MHz，3mm梯度反相探头上用两天的时间收集波谱信号得到NOE图。

虽然收集的样品中有很多杂质，但是能看到葡萄糖苷酸连接在C-4位，照射亚甲基，I峰从H-2和H-6得到NOE信号。对M11样品进行LC-MS分析，只是1-(3-氯苯基)哌嗪，1H -NMR谱缺乏独立的亚甲基峰，也说明该物质为1-(3-氯苯基)哌嗪(图6)。

2003年，M.V. Silva Elipe[11]实验室还利用LC-NMR研究了分子量较小的放射性的挥发性代谢物，利用 UV检测器来标定代谢物，实验证实较少的进样量，UV检测器即能分辨出代谢物。Wilson等[12]使用驻流操作方式进行了安替比林的药物代谢研究。给自愿者服用1g 4-羟安替比林(antipyrine)后，收集其尿液冷冻干燥处理，然后用乙睛/水作流动相，以驻流的操作方式进行HPLC-NMR分析。

驻流操作方式和连续流方式相比，具有如下优点：首先使用驻流方式进行分析，可以长时间对样品扫描，因此所得谱图精度高，结构信息较充分；其次即使含量较少的组分也可以通过NMR累加扫描来得到结构信息，从而实现了系统较高的灵敏度，这是连续流操作方式所不能做到的；最后，使用驻流操作方式可作COSY、TOCSY等二维谱，得到大量通过一维谱不易获得的结构信息。所以，驻流操作方式是目前应用最广泛的HPLC-NMR操作方式。

2.7其他与NMR技术联用的分离手段

其他色谱技术也在与NMR进行在线联用，例如，尺寸排阻色谱(SEC)与NMR联用方法来分析聚合物中的添加剂，固相萃取(SPE)与NMR联用进行痕量分析，毛细管电泳与NMR联用(CE-NMR)以及毛细管电泳色谱与NMR联用(CEC-NMR)分析小样品量的代谢物。CE-NMR和CEC-NMR采用小体积池带毛细管分离的NMR探头，取得了很大的进步，毛细管HPLC(capLC)与NMR联用(capLC-NMR)采用了商业化的微量探头，这样分析的样品量达到了纳克的量级。采用该技术，色谱峰的体积与NMR探头的流动池的体积相当，流动池的体积大约1.5μL，而且比常规的LC-NMR有更宽的溶剂梯度；capLC-NMR不需浓缩的纯化合物，只需分析混合物的柱子，唯一的要求就是样品必须溶解在5μL或更少的溶剂中。capLC的UV检测器与NMR流动池之间的延迟时间必须校正，因为不同的色谱条件，不同的溶剂组成，溶液的粘度不同，会影响泵的效率。现在开发了一种多线圈的探头，同时采集不同成分的NMR谱，至今为止，可以同时采集4种样品，以后也许可以同时采集96个样品，就像LC-MS一样[5]。

2.8 LC-NMR应用

在天然产物领域，LC-NMR广泛用于分析萃取物中的植物碱和海洋植物碱、类黄酮、倍半萜烯内酯、皂石、维生素E同系物以及抗菌成分；在药物代谢物研究方面，LC-NMR广泛由于代谢物、极性代谢物或不稳定代谢物的指认；最后，LC-NMR还可用于降解产物、药物杂质以及药物开发、食品分析等方面。

一般来说，在药物和药理分析中样品的组成是非常复杂的，如果要得到样品中组分的明确结构，必须先将各组分很好地分离开在作结构鉴定。HPLC-NMR能够将分离和结构鉴定连为一体，大大简化了分析过程。因此HPLC-NMR在药物化学中得到了相当普遍的应用，并已经被证明是这一领域中最强有力的分析手段之一。Akira[13]利用HPLC-NMR研究了一种新型牛磺酸相关代谢物的代谢组学，Spraul[14]报道了使用HPLC-NMR进行药物代谢研究：将服用了消炎药布洛芬的实验者的尿液冷冻干燥处理后，分别使用HPLC-NMR的连续流和驻流操作方法进行分析，并在驻流操作时使用了二维谱得到代谢产物的明确结构。后来又有人用同样的方法作了动物尿液中布洛芬第二阶段代谢产物的分析。从此HPLC-NMR在药物化学特别是在药物代谢中的应用得到了迅速的发展。

另外，已经有人开始把HPLC-NMR方法应用于质量控制。例如：Pasch等[15]用HPLC-NMR对低聚苯乙烯的构型规整度进行评估，还有用HPLC-NMR监测手性合成、控制产物比例[16]等。

3　展望

HPLC-NMR技术分析复杂样品速度快且能得出明确的结构信息，已成为最强有力的分析手段之一。但这种分析手段目前还存在检出限高，不能分析太大分子等特点，所以目前这一方面发表的论文数量不多。预计今后主要有三个发展方向：(1)提高NMR仪器的技术性能。这方面包括使用超高频的NMR仪器(目前已经有900MHz谱仪投入使用)、改进NMR探头和使用低温液体冷却前置放大器，从而大大提高仪器灵敏度，降低检出限。(2)研究HPLC-NMR-MS技术。HPLC-MS技术自从电喷雾电离方法(Electrospray Ionization)的使用以来，已经成为一种比较成熟的和强有力的混合物分析手段。如果将MS甚至MS/MS与HPLC-NMR连接，则可能在一次色谱分析中同时得到MS和NMR的信息。国外的一些学者已经在这方面作了一些尝试并取得了初步的成功。(3)研究CE-NMR技术。毛细管(CE)和HPLC不同之处在于使用外加压力来达到分离目的。其分离效率要比HPLC高很多。目前CE-NMR联用技术的主要困难在于CE进样量比起NMR的检出限小很多，只有样品中组分浓度较高时才能体现其灵敏度高的特点。最近有人尝试用CE-NMR分析纳米级的样品并取得了一定的成功。由于CE在分离性能上的优势，随着硬件技术的发展，CE-NMR很可能会成为一种非常重要的结构鉴定手段。

仪器联用技术增强了化合物结构分析的能力，如今LC-NMR技术的发展使之拓展了复杂混合物的结构分析能力，但是LC-NMR由于其检测灵敏度偏低，昂贵的氘代试剂、溶剂峰的抑制、色谱峰体积与NMR流动池之间的兼容性等方面的原因，因此是无法与LC-MS相提并论的；为了克服上述缺陷，开发capLC(毛细管液相色谱)-NMR联用技术，减少溶剂量，色谱峰的体积也与NMR流动池体积兼容，将是LC-NMR联用技术的发展方向。

至于采用哪一项联用技术，具体情况具体分析，取决于问题的难度和本质，每一项技术均有它的优缺点，要了解它们的优缺点，便于我们作出准确的选择。

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Research progress of LC-NMR technology.

Wu Chunhong1,2

(1.YanshanBranchofBeijingResearchInstituteofchemicalindustry,SINOPEC,Beijing102500,China;2.NationalEngineeringResearchCenterforSynthesisofNovelRubberandPlastic,Beijing102500,China)

This article introduced the development process of LC-NMR including NMR sensitivity and solvent compatibility, solvent peak suppression, NMR probe design, operation modes. And the operation modes of continuous flow and stopped flow were compared.

LC-NMR; continuous flow; stopped flow

吴春红，分析化学专业博士学位，高级工程师，研究方向是核磁共振波谱分析，E-mail:wuch.bjhy@sinopec.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.001

2015-09-06