不同年份生产帝泊洱茶珍HPLC指纹图谱研究

刘顺航,徐咏全,李长文,何忠荣,王 超



不同年份生产帝泊洱茶珍HPLC指纹图谱研究

刘顺航,徐咏全,李长文,何忠荣,王 超*

(云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司,云南 普洱 665000)

本研究对2011～2014年生产的20个帝泊洱茶珍样品进行分析,建立了帝泊洱茶珍高效液相色谱指纹图谱,同时结合化学计量学对帝泊洱茶珍和竞品茶珍进行区分.结果表明:指纹图谱相似性分析,帝泊洱茶珍相似系数均大于0.995,而10个竞品茶珍相似度均小于0.970.通过系统聚类和偏最小二乘判别分析,可明显区分帝泊洱茶珍和竞品茶珍.变量投影重要性准则研究显示,没食子酸(GA)、3号峰(未知物)、没食子儿茶素(GC)、儿茶素(C)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)等5种化合物相对含量的不同是区分帝泊洱茶珍与竞品茶珍主要因素.

帝泊洱茶珍;高效液相色谱;指纹图谱;化学计量学

普洱茶是一种独特的后发酵茶,主要产自中国云南省,它的制作和运输销售已有上千年的历史[1].近年来,由于其抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降血糖、减肥等功效[2],以及其独特的口感,越来越受到国内外消费者的青睐.普洱茶珍,是一种为迎合大众健康快节奏生活方式应运而生的经浸提、浓缩、喷粉和冷冻干燥制成的普洱茶速溶茶.

茶一直以感官审评作为其品质评价的主要方式,但由于评价环境、审评设备、审评人员工作经验、审评人员身体状况等不稳定因素的影响,不可避免地导致审评结果有时会出现较大的个体偏差.因此,寻找科学、全面、可量化的茶品质评价和质量监控方法,已成为茶领域研究的重点和热点.

1976年,Hoefler等人首次应用中药指纹图谱技术研究了茶叶组成成分,为茶叶高效液相色谱分析方法首开先例[3].近年,针对普洱茶指纹图谱的研究已有相关报道.宁井铭等[4-6]针对普洱晒青毛茶和普洱生茶指纹图谱作了大量工作,从指纹图谱的整体性出发,利用相关系数,夹角余弦、重叠率、系统聚类和主成分分析等识别模式,对普洱茶晒青毛茶和绿茶、不同等级普洱生茶进行了分析和区分.李扬等[7]发现景迈茶区不同晒青毛茶样品的指纹图谱具有极高的相似度,但景迈茶区晒青毛茶的标准图谱与其他地区茶样间的相似度差异较大.张梁等[8]又进行了不同产地普洱生茶和普洱熟茶指纹图谱的建立,为两者的质量评价提供了依据.

本研究采用高效液相(HPLC)建立不同年份帝泊洱茶珍指纹图谱,并结合化学计量学方法对帝泊洱茶珍和竞品进行区分,旨在为帝泊洱茶珍质量控制和竞品判别提供可量化的手段.

1　材料与方法

1.1材料与仪器

20个批次帝泊洱普洱茶珍(表1),云南帝泊洱生物茶集团有限公司;10个竞品茶珍(表1),购于普洱市场;乙腈(色谱纯)(美国TEDIA公司);磷酸(色谱纯)(Aladdin,中国,上海).Waters e2695-2489高效液相色谱仪(美国waters公司);电子分析天平(梅特勒公司); Mill-Q超纯水净化系统(美国 Millipore公司).

表1　普洱茶珍样品信息Table 1 The information on the samples of Pu-erh tea extract

1.2实验方法

1.2.1供试液的制备

称取茶珍样品0.1500±0.0002 g,至50 mL烧杯中,加入30 mL超纯水,30℃水浴超声5 min,使茶粉充分溶解.超声后转移至50 mL容量瓶中,加水定容至刻度,过0.45 μm尼龙滤膜后备用.

1.2.2色谱条件

色谱柱:Synergi 4u Hydro-RP 80AC18柱(250 mm X 4.6 mm ID, 美国菲罗门公司);流动相A:乙腈(含0.05%磷酸),流动相B:水(含0.05%磷酸);进样量10 μL;柱温30 ºC;检测波长210 nm;流速为1.0 mL.min-1;梯度洗脱程序为0～50 min,2% A、98% B → 25% A、75% B; 50～55 min,25% A、75% B→2% A、98% B;进下一样品之前2% A、98% B平衡色谱柱15 min.

1.2.3数据处理

采用《中药指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件(中国,北京)分析茶珍HPLC指纹图谱数据,确定共有峰,生成对照指纹图谱并进行相似度计算.采用IBM SPSS Statistics 20进行系统聚类(HCA).SIMCA-P+12.0进行帝泊洱茶珍和竞品茶珍差异计算.

2　结果与分析

2.1指纹图谱的构建和解析

2.1.1共有峰的标记

对20批茶珍进行指纹图谱分析,以咖啡因作为参考峰,标定了13个共有峰,分别为1号(11.621 min)、2号(13.209 min)、3号(14.304 min)、4号(17.762 min)、5号(18.403 min)、6号(25.006 min)、7号(27.243 min)、8号(29.120 min)、9号(32.608 min)、10号(34.546 min)、11号(37.199 min)、12号(43.428 min)和13号(44.882 min),其中8号峰为咖啡因(图1).

2.1.2 相似度计算

将20批帝泊洱茶珍的指纹图谱导入国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件,经多点校正,色谱峰匹配及生成对照图谱,以中位数生成茶珍对照指纹图谱,将该对照指纹图谱的相似度定为1,计算得出20批次茶珍的相似度均在0.996～0.999(表2),表明茶珍在长期的存放过程中,化学成分和其含量变化较小,茶珍产品稳定性较高(图2).以20批帝泊洱茶珍的对照指纹图谱为参照,计算得出10个竞品茶珍的相似度在0.938～0.963 (表2).表明了竞品茶珍与帝泊洱茶珍之间存在差别.

图1　20批茶珍对照色谱图(8号为咖啡因)Fig. 1 The chromatomap of 20 tea extract samples (No.8 caffeine)

表2　帝泊洱茶珍和竞品茶珍相似度Table 2 The similarity of 20 tea extract samples between Deepure and Pu-erh tea

图2　20批茶珍HPLC色谱图Fig. 2 The HPLC chromatomap of 20 Pu-erh tea extract

2.2帝泊洱茶珍与竞品茶珍系统聚类分析

应用SPSS软件对帝泊洱的20批茶珍和10个竞品茶珍中13个共有峰的相对峰面积进行系统聚类分析.从图3中可以看到聚类的趋势, 30个茶珍样品系统聚类的结果可分为两大类(线II):帝泊洱茶珍聚为一大类,竞品茶珍聚为一大类.在帝泊洱茶珍样品中,阈值最低层(线I)被划分一类的样品来自同一年份,能够较好的聚集在一起成为一类.10个竞品茶珍与帝泊洱茶珍差异性较大,聚为一大类;同时从竞品茶珍聚类看,10个厂家的茶珍之间也能很好的聚为小类.

图3　30个茶珍样品系统聚类分析图Fig. 3 The Systematic Assembling Analytical Map of 30 pu-erh tea extract samples

2.3帝泊洱茶珍与竞品茶珍差异分析

以30个茶珍样品中13个共有峰的相对峰面积为变量进行偏最小二乘判别分析,建立PLS-DA模型(图4)研究帝泊洱茶珍与竞品茶珍的差异.结果显示,帝泊洱茶珍与竞品茶珍呈现明显的分离趋势,帝泊洱不同年份茶珍聚集同样出现分离趋势,说明茶珍在长期存放过程中基础物质仍有细微的变化.为了进一步探究引起茶珍之间差异的重要化学信息,按照PLS-DA结果对30批茶珍指纹图谱中13个共有色谱峰VIP值大小进行排序,其中5个色谱峰(峰2-GA、峰3-unknow、峰5-GC、峰7-C和峰10-EGCG)VIP值>1(图5),这5种化合物含量的不同是区分帝泊洱茶珍与竞品茶珍的主要因素.

图4　30个茶珍样品PLS-DA分析得分散点图Fig. 4　The distribution point map of 30 pu-erh tea extract samples

图5　变量投影重要性准则图Fig. 5 The Variable projection importance criterion

3　结论

系统聚类、偏最小二乘分析和变量投影重要性准则作为化学计量学方法,能够找到隐藏在众多共性下的差异.本文利用指纹图谱技术建立了不同年份帝泊洱茶珍HPLC指纹图谱,共标记了13个共有峰,帝泊洱不同年份的20个批次茶珍相似度均≥0.996;以帝泊洱20批次茶珍对照指纹图谱为参照,10个竞品茶珍的相似度均≤0.963.以13个共有峰的相对峰面积为变量,对帝泊洱20批茶珍和10个竞品茶珍进行化学计量学分析,聚类分析结果显示系统聚类可对帝泊洱茶竞品茶珍进行区分;进一步进行偏最小二乘判别分析,结果与聚类分析相似,变量投影重要性准则分析显示,5个化合物(峰2-GA,峰3-unknow,峰5-GC,峰7-C和峰10-EGCG)相对含量的差别是区分帝泊洱茶珍与竞品茶珍的重要因素.

本实验建立的HPLC指纹图谱分析方法,能够使帝泊洱茶珍共有成分在色谱中体现,所建立的指纹图谱具有较好的稳定性与可控性,可进一步用于帝泊洱茶珍质量的控制,同时可作为帝泊洱茶珍与竞品茶珍区分的一种手段.

[1] 阳耀芳. "茶马古道" 的历史研究与现实意义 [J]. 茶叶通讯, 2009, 36(1)∶ 44-47.

[2] 李晨晨, 吕杰, 杨瑞娟, 等. 普洱茶渥堆发酵过程中嗜热细菌的分离和鉴定 [J]. 北京化工大学学报∶ 自然科学版, 2012, 39(2)∶ 74-78.

[3] Hoefler A. C, Coggon P. Reversed-phase high-performance liquid chromatography of tea constituents [J]. Journal of Chromatography A, 1976 (129)∶ 460-463.

[4] 宁井铭,张正竹,谷勋刚,等. 基于高效液相色谱的普洱晒青毛茶指纹图谱识别方法 [J]. 农业工程学报, 2010, 26(3)∶243-248.

[5] 宁井铭,张正竹,谷勋刚,等. 云南晒青毛茶HPLC指纹图谱的研究 [J]. 食品与发酵工业, 2009(9)∶36-40.

[6] 宁井铭, 颜玲,宛晓春,等. 基于HPLC技术的普洱生茶指纹图谱研究 [J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(2)∶200-206.

[7] 李扬, 周斌星, 杨超, 等. 建立景迈茶区春季晒青毛茶指纹图谱的研究 [J]. 江西农业学报, 2012, 24(6)∶153-155.

[8] 张梁, 李宁, 车彦云, 等. 普洱熟茶和普洱生茶的指纹图谱研究(英文) [J]. 中国药学杂志, 2011, 20(4)∶ 352-359.

Study on Deepure Instant Pu-erh Tea from Different years by HPLC Fingerprint

LIU Shun-hang,XU Yong-quan,LI Chang-wen,HE Zhong-rong,WANG Chao*
(Yunnan Tasly Deepure Biological Tea Group Co., Ltd, Pu'er 665000, China)

In this study, 20 batches Deepure instant pu-erh tea samples from 2011-2014 were evaluated by using high liquid chromatography (HPLC) fingerprint. Meanwhile, the Deepure instant pu-erh tea samples were authenticated within different manufacturers by chemometrics method. The chemometrics method included hierarchical clustering analysis, partial least squares-discriminant analysis and variable importance for the project analysis. Results showed that the similarities of 20 batches of instant pu-erh tea samples were more than 0.995, and the 10 similar products were lower than 0.970. The Deepure instant pu-erh tea samples and similar products can be significantly distinguished by hierarchical clustering analysis, partial least squares-discriminant analysis. The results of variable importance for the study showed that five compounds were the important factors for discrimination of samples.

Deepure instant pu-erh tea, High liquid chromatography, Fingerprint, Chemometrics method

O657.72,TS272.7

A

1009-525X(2016)02-24-29

2016-04-29

2016-05-30

刘顺航(1976-),男,福建仙游人,高级工程师,主要从事普洱茶提取和安全控制方面的研究.

王超,wangchao2809@126.com