IDO-siRNA对胃癌细胞株MGC803中IDO与IL-6水平的影响

贾丽君肖菊香西安交通大学第二附属医院肿瘤科，西安74西安交通大学第一附属医院肿瘤科，西安76

IDO-siRNA对胃癌细胞株MGC803中IDO与IL-6水平的影响

贾丽君1#肖菊香2
1西安交通大学第二附属医院肿瘤科，西安7100042西安交通大学第一附属医院肿瘤科，西安7100610

目的本实验以吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）为切入点，对比分析IDO-siRNA干扰前后胃癌细胞株MGC803中IDO及IL-6表达水平变化，研究IDO在胃癌及抑郁中发生、发展的作用，探讨胃癌促发抑郁的可能分子机制。方法采用siRNA干扰技术转染胃癌细胞株MGC803，免疫细胞化学法及RT-PCR法观察IDO蛋白及基因水平的变化，ELISA法检测转染siRNA前后胃癌细胞株上清液中IL-6表达水平，研究IDO对胃癌细胞株以及抑郁相关细胞因子的影响。结果胃癌细胞MGC803经转染IDO-siRNA后IDO的表达经免疫细胞化学及RTPCR法的检测均明显下降（P＜0.05）；转染IDO-siRNA 24 h后胃癌细胞MGC803的细胞上清液中IL-6的表达较未转染前明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论IDO在胃癌细胞株MGC803中高表达；IDO-siRNA可抑制胃癌细胞株MGC803中IDO的表达；胃癌细胞株MGC803经IDO-siRNA干扰后分泌的细胞因子IL-6的表达减弱，表明IDO与IL-6的表达存在关联，IL-6可能在胃癌及抑郁的发生发展中起一定的作用。

胃癌；IDO；IL-6；siRNA

Oncol Prog，2016，14（5）

胃癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率和病死率分别位居恶性肿瘤的第五位和第三位，具有发病率高、发病隐匿、易转移和病死率高等特点［1］。胃癌的发病因素有很多，随着医学模式的转变，社会心理因素在癌症的发生、发展及预后中的作用越来越受到关注。近年来，针对恶性肿瘤患者心理健康状况的研究表明患者情绪障碍发生率很高，其中以抑郁最为常见。抑郁作为恶性肿瘤患者最常见的心理障碍之一，直接影响肿瘤的发生、发展和预后，降低患者的生活质量［2］。因恶性肿瘤与抑郁之间互相影响，故对肿瘤和抑郁以及二者之间相互关系的研究就具有重要的临床意义。

吲哚胺2，3双加氧酶（Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO），是肝脏以外唯一可催化色氨酸分解代谢的限速酶，色氨酸是细胞维持活化和增殖所必需的氨基酸，也是神经递质5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的前体［3］。研究发现胃癌中有IDO的高表达，而IDO与抑郁的发生发展密切相关［4］，还与肿瘤免疫抑制及肿瘤耐药等相关。白细胞介素-6（in-terleukin-6，IL-6）是一种多功能的细胞因子，可在多种肿瘤组织和细胞中表达，影响肿瘤的增殖和分化，还可影响神经内分泌功能及5-HT的代谢，从而与抑郁密切相关［5］。IDO与IL-6也可相互作用。IL-6可通过干扰素非依赖途径参与IDO表达调控，IDO又可通过分解色氨酸在一定程度上增强IL-6的作用［6］。因此研究二者在胃癌细胞株中的表达，并探讨两者之间的相互关系对阐明胃癌及肿瘤相关性抑郁发生的机制具有重要意义。

1　材料与方法

1.1实验材料

人胃癌细胞系MGC803来自西安交通大学医学院肿瘤研究所；RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青公司；胰蛋白酶购自Solarbio公司；兔抗人IDO多克隆抗体购自英国ABCAM公司；SP免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；siRNA合成由广州锐博生物科技有限公司提供；PCR引物合成，RNAiso Plus，逆转录试剂盒，TaKaRa Ex Taq试剂盒及DNA marker均购自大连宝生物工程有限公司。

1.2细胞培养

人胃癌细胞系MGC803由西安交通大学医学院肿瘤研究所保存，在含10%胎牛血清和100 U/mL青链霉素双抗的RPMI 1640中，于37℃，饱和湿度及5%CO2的培养箱内传代培养。

1.3免疫组织化学染色

取对数生长期MGC803细胞以1.0×105/ml密度接种于盖玻片上，0.3%TritonX-100作用增加胞膜通透性，3%过氧化氢去离子水孵育阻断内源性过氧化酶活性，10%山羊血清（PBS稀释）闭阻断非特异性抗原，加一抗4℃过夜，加羊抗兔二抗工作液孵育，加辣根酶标记的链酶卵白素工作液孵育后PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树脂封片，镜下观察，先在低倍镜（×100）下确定目标，每张切片随机选择5个高倍镜视野（×400），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。

1.4 IDO-siRNA转染MGC803胃癌细胞

取对数生长期细胞为实验对象，分4组：空白对照组（未转染）、阴性对照组（转染脂质体组）、阳性对照组（β-actin-siRNA）及IDO-siRNA转染组。详细序列如下：

IDO-siRNA β-actin-siRNA阴性对照正义链5'GAACGGGACACUUUGCUAAdTdT3'反义链3'dTdT CUUGCCCUGUGAAACGAUU5' ssD1021 ssD1022（购买siRNA质粒代码）siNO5815122147

转染前1天将胃癌细胞接种到六孔板，siRNA作用后分别于24 h及48 h检测基因表达，48 h检测蛋白表达。

1.5 RT-PCR检测各组细胞IDO mRNA表达

转染siRNA 48 h后，Trizol试剂提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作步骤，获取检测各实验组cDNA并进行PCR扩增。引物序列如下：

IDOβ-actin上游：5'GCTTGCAGGAATCAGGATGT3'下游：5'GGCAAAGGTCATGGAGATGT3'上游：5'ATCGTG CGTGACATTAAGGAGAAG3'下游：3'AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG5'

PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，59.7℃退火20 s，72℃延伸1 min，共30个循环。取PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像仪分析，以IDO/β-actin条带灰度值的比值代表其mRNA的相对表达量。

1.6 IL-6表达水平的检测

分别提取胃癌细胞MGC803、转染IDO-siRNA或阴性对照24 h后细胞的细胞上清，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后分别加入未转染细胞上清、转染IDO-siRNA 24 h后细胞上清及转染阴性对照24 h后细胞上清各再10 μl，用封板膜封板后置37℃温育30 min，加洗涤液洗涤5次后每孔加入酶标试剂50 μl，继续温育及洗涤各1次，显色，终止，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD）值。

1.7统计学处理

所有数据采用SPSS17.0统计软件包处理。由于数据不符合正态分布，各组间计量资料比较用非参数秩和检验，Mann-Whitney U检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 IDO-siRNA干扰前后人胃癌细胞系MGC803细胞中IDO表达比较

人胃癌细胞系MGC803细胞中IDO表达阳性，主要表达于细胞质中，呈淡黄色至棕褐色颗粒状；胃癌细胞MGC803经IDO-siRNA干扰后，胞质呈淡蓝色，到黄色或棕褐色颗粒状沉淀少见，IDO蛋白的表达明显减弱。（图1）

图1　IDO-siRNAsiRNA干扰前后人胃癌细胞系MGCMGC803803细胞中IDOIDO蛋白表达（×400400）

2.2 RT-PCR结果

RT-PCR分析表明人胃癌细胞株MGC803中IDO基因在mRNA水平呈高表达。MGC803胃癌细胞转染IDO-siRNA后，于24 h进行检测，结果显示IDO mRNA表达量明显低于空白对照组、阳性对照组及阴性对照组（P＜0.05）；而空白对照组、阳性对照组及阴性对照组间两两比较均无统计学差异（P＞0.05）（图2，表1）。

图2　转染后MGCMGC803803细胞β -actinactin和IDOIDO的表达

表1　 IDOIDO-siRNAsiRNA干扰前后MGCMGC803803细胞IDOIDO mRNAmRNA的表达

2.3 IL-6水平的变化

分别测胃癌细胞MGC803、转染IDO-siRNA 24 h后细胞上清中IL-6的表达。IDO-siRNA组细胞上清IL-6浓度为（1.366±0.036），低于空白对照组的（1.931±0.038），差异具有统计学意义（P＜0.01）。

3　讨论

胃癌的发生是外源性因素和机体内在因素等多种因素综合作用的结果。社会心理因素在胃癌的发生发展中的作用日益受到关注［7］，因癌症的转移易复发及死亡率高等特殊性，患者往往有较重的心理负担，加上癌症所带来的疼痛，手术导致的形体及功能的改变，化疗过程中的恶心呕吐等不良反应，病程长经济负担重等原因，癌症抑郁的发生率很高。而抑郁亦对肿瘤产生影响，抑郁障碍启动神经内分泌系统与免疫系统环路，使机体免疫功能下降，影响癌症的发生发展［8］。因抑郁与癌症之间互相影响，故探讨胃癌引发抑郁及抑郁促进胃癌发生发展可能的分子机制，可为改善胃癌患者的抑郁状况及预后提供临床思路。

近年来，很多研究表明IDO与单胺能递质、细胞因子及神经元可塑性密切相关，在抑郁症的发病及治疗中具有重要作用。研究显示IDO水平与抑郁样症状呈正相关，且其基线水平与6年后追踪调查中人群的抑郁样症状呈正相关［9］。动物研究表明中枢或外周给予脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）导致小鼠体内IDO活性增强，出现抑郁样行为，而提前给予IDO竞争性抑制剂可抑制IDO的活性，抑制小鼠抑郁样行为的出现［10］。IDO的活性表达导致细胞色氨酸的耗竭及其分解代谢过程中产生的多种物质，已有大量研究表明IDO在肿瘤组织中有高表达，提示IDO与多种恶性肿瘤的免疫逃逸、肿瘤耐药及预后密切相关，尤其在恶性肿瘤相关性抑郁中起重要作用［11］，是肿瘤的不良预后指标之一，而RNA干扰技术可直接对IDO的表达进行抑制［12］，从而有可能成为一个新的治疗方法来控制肿瘤发展和改善肿瘤抑郁患者的生活质量。

本组研究首先从细胞水平出发，证明了IDO在胃癌细胞株MGC803中表达。其次成功转染IDO-siRNA至胃癌MGC803细胞，应用免疫组化及RTPCR法证实胃癌MGC803细胞中的IDO被成功沉默，酶联免疫检测证实了IDO-siRNA能显著减少胃癌细胞中IL-6的表达。IL-6是一种多功能的细胞因子，主要通过自分泌和旁分泌的方式产生［13］。大量研究表明，IL-6能促进肿瘤的生长，并对其扩散和转移也有一定作用。随着抑郁症细胞因子学说的提出，IL-6在抑郁发生发展中的作用也越来越被关注。IL-6可通过影响神经内分泌功能、与氧化应激共同作用引起抑郁［14］，但其确切机制仍有待进一步研究。IDO可通过降解色氨酸抑制一些蛋白的合成从而抑制IL-6的表达，从而缓解抑郁症状［15］。本组研究检测了干扰前后胃癌细胞上清中细胞因子IL-6的水平，结果显示经IDO-siRNA干扰后胃癌细胞上清中IL-6明显降低（P＜0.01）。因此，IDO能有效减少胃癌细胞中IL-6的表达，从而延缓肿瘤进展，并减少抑郁症的发生。当然也有研究显示，IL-6能通过干扰素非依赖途径激活IDO，但是本研究并未进行相关实验证实。

综上所述，IDO在胃癌细胞株MGC803中有表达，用IDO-siRNA转染后，IDO的表达可明显减弱，且干扰后胃癌细胞株分泌的细胞因子IL-6的表达也降低。因此IDO作为肿瘤与抑郁发生发展的桥梁，可为探索胃癌的潜在治疗靶点及防治肿瘤相关性抑郁提供理论依据。

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The effectt of IDO-siRNA on indoleamine 2.3-dioxygenase and interleukiinn-- 66 iinn gastric cancer cell line MGC803

JIALi-jun1#XIAO Ju-xiang2
1Department of Oncology，Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China2Department of Oncology，First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

ObjectivectiveTo observe the expression levels of indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO）and the secretion of interleukin-6（IL-6）in gastric cancer cell line MGC803 before and after the application of IDO-siRNA，to investigate the effect of IDO in the development of gastric cancer and cancer related depression.MethodethodGastric cancer cell line MGC803 was transfected with siRNA，the expression changes of IDO-siRNA and IDO protein were determined by RTPCR and immunocytochemistry.The change of IL-6 secretion was measured by ELISA.The effect of IDO on cancer cell line and depression related cytokines was investigated.ResultesultAfter application of IDO-siRNA，the expression of IDO and the secretion of IL-6 in the gastric cancer cell line MGC803 was decreased significantly（P＜0.01）.ConclusionusionIDO is highly expressed in gastric cancer cell line MGC803；IDO-siRNA can inhibit the expression of IDO in gastric cancer cell line MGC803：after application of IDO-siRNA，the secretion of IL-6 was decreased significantly in gastric cancer cell line MGC803，indicating that IDO expression and IL-6 was positively correlated，and IL-6 might be engaged in the development of gastric cancer and related depression.

rdsgastric cancer；indoleamine 2，3-dioxygenase；interleukin-6；siRNA

R735. 2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.05.19

（corresponding author），邮箱：jialijun112@163.com

2015-12-08）