藏药佐木阿汤对高原红细胞增多症模型大鼠心肌细胞线粒体DNA的影响*

鲁梦倩，尼玛次仁，于天源△，冼思彤，多杰仁青，潘　璠，巴桑德吉，张林峰，陈国勇，吴剑聪北京中医药大学，北京 0009；西藏藏医学院；西藏自治区藏医药研究院；北京按摩医院

藏药佐木阿汤对高原红细胞增多症模型大鼠心肌细胞线粒体DNA的影响*

鲁梦倩1，尼玛次仁2，于天源1△，冼思彤1，多杰仁青2，潘璠1，巴桑德吉3，张林峰1，陈国勇1，吴剑聪4
1北京中医药大学，北京 100029；2西藏藏医学院；3西藏自治区藏医药研究院；4北京按摩医院

目的：观察藏药佐木阿汤对高原红细胞增多症（HAPC）模型大鼠心肌细胞线粒体DNA（mtDNA）及DNA聚合酶γ等指标表达的影响，探究佐木阿汤对心肌线粒体的保护作用。方法：选用雄性Wistar大鼠32只，随机分为平原对照组、高原模型组、阳性药物组、佐木阿汤组，每组各8只。除平原对照组外，余组均饲养于拉萨以建立HAPC模型，饲养1个月后分别进行生理盐水、红景天和佐木阿汤灌胃干预，干预3个月后取材，采用Real time PCR、ELISA、Western blot方法分别检测大鼠心肌mtDNA、8-OHdG、DNA聚合酶γ含量。结果：mtDNA含量高原对照组与平原对照组相比，显著降低差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与高原对照组相比，明显升高（P＜0.05）；但与平原对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。8-OHdG高原对照组与平原对照组相比，显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与高原对照组相比，显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与平原对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。DNA聚合酶γ含量高原对照组与平原对照组相比，显著降低差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与高原对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与平原对照组相比，无明显增加差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：佐木阿汤干预HAPC模型大鼠后，心肌mtDNA与DNA聚合酶γ均显著增多，损伤产物8-OHdG显著降低，佐木阿汤可促进线粒体DNA损伤的修复，从而使心肌线粒体的结构和功能逐渐恢复正常，改善HAPC模型大鼠心肌的缺血缺氧状态。

高原红细胞增多症；动物实验；大鼠；佐木阿汤；线粒体DNA；心肌

高原红细胞增多症（H i g h A l t i t u de p o l ycyt h e m i a，H APC），是长期在高原低压低氧环境中生活而引起的一种慢性高原病。其主要症状和体征有头痛、头晕、乏力、睡眠困难、紫绀、结膜充血等［1］，并伴有突出的心血管病变，可造成心肌损伤甚至心肌坏死，对机体多个组织器官造成损害，甚至导致患者丧失生活与劳动能力，严重影响高原地区人民的健康［2］。转入低海拔地区治疗可使红细胞含量迅速下降，是最有效的治疗方法，但目前国内外仍缺乏有效的就地根治此病的方法［3］。佐木阿汤是藏医治疗H APC的经典方，它能预防H APC引发的多种疾病，并有积极的辅助治疗作用。课题组前期研究表明佐木阿汤对H APC有明显的治疗作用，可降低H APC模型大鼠红细胞数、血液黏稠度，保护心肌的超微结构，促进氧化损伤的恢复［4-5］。为了探究佐木阿汤对心肌线粒体的保护作用，本次研究主要观测H APC模型大鼠心肌线粒体D N A（m t D N A）的氧化损伤及D N A聚合酶γ表达的变化，从而进一步探究佐木阿汤防治H APC的作用机理。

1　材料与方法

1.1动物选用清洁级6周龄（180±10g）W i star大鼠，雄性，共32只。购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：S C X K（京）2014-0001。

1.2药物佐木阿汤：藏锦鸡儿11 g，巴夏嘎14 g，兔耳草11 g，儿茶7 g，矮紫堇7 g（购自西藏甘露藏药股份有限公司），共50 g佐木阿汤生药加500mL水，煮30分钟，缩汁至350 mL，过滤药渣后使用，此时生药浓度为0.143 g/mL。阳性对照药：红景天10 g（购自拉萨康珠药店），加100mL水煮沸，收汁至50mL，过滤药渣后使用，此时生药浓度为0.2 g/mL。

1.3主要试剂及仪器兔单克隆聚合酶γ抗体（abca m公司，美国），8-O H d G的E L I S A试剂盒（武汉华美生物工程有限公司提供），5804R多功能台式离心机（E pp e n dor公司，德国），荧光定量PC R仪（7700，A B I P R I S M公司，美国），紫外分光光度计（T U-1901，北京普析通用仪器有限责任公司提供）。

1.4方法根据随机数字表法制定分组方案，将动物随机分为平原对照组、高原模型组、阳性药物组、佐木阿汤组各8只，共32只。

1.4.1造模高原模型组、阳性药物组、佐木阿汤组大鼠空运至拉萨“西藏自治区藏医药与高原生物省部共建实验室”（海拔3740米）饲养，通过高原低压低氧环境进行实地H APC造模。运至高原适应性饲养1w，并造模1个月后，开始干预。平原对照组同期在北京中医药大学（海拔43米）饲养。

1.4.2干预平原对照组和高原模型组：每天以生理盐水5mL灌胃；阳性药物组：以红景天水提溶液灌胃，剂量为20 mL/（k g·d）；佐木阿汤组：以7.5 mL/（k g·d）的剂量灌胃。每组均1次/d，6次/周，每周休息1天，共干预3个月。

1.4.3取材及指标检测

1.4.3.1心肌m t D N A测定处死后取各组大鼠心肌组织，采用R ea l t i m e PC R方法，对心肌的m t D N A进行扩增，引物序列为上游5′-GG CAACCAAACA G AAC G C TT-3′下游5′-GG A G C TT C T AC GTGGG C TTT-3′（由鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成），扩增片段长度263 b p，内参β-act i n（引物由上海生工提供），扩增片段长度256 b p。通过检测荧光值，比对m t D N A的相对扩增情况，由此检测各组大鼠心肌组织m t D N A的含量及损伤情况。

1.4.3.2心肌8-O H d G的测定处死后取各组大鼠心肌组织，提取m t D N A后，采用E L I S A法检测m t D N A内8-O H d G的含量，检测步骤按试剂盒的说明书进行，取两次结果的平均值。

1.4.3.3心肌D N A聚合酶蛋白表达测定处死后取各组大鼠心肌组织，采用W ester n b l ot法进行检测并照相，用G e l-P ro软件分析信号A值，计算各组大鼠的目的蛋白相对于内参t u b u l i n的相对A值（即相对含量），以此对比各组大鼠的D N A修复能力。

1.5统计学方法数据采用S P SS 17.0统计软件进行分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析，不满足方差分析条件时采用秩和检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1心肌mtDNA扩增结果采用R ea l t i m e PC R方法检测各组大鼠心肌组织m t D N A的相对拷贝数，观测m t D N A的损伤情况。结果显示，m t D N A含量高原对照组与平原对照组相比，明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与高原对照组相比，明显升高差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与平原对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2心肌8-OHdG含量结果采用E L I S A方法检测心肌组织8-O H d G的含量，判断心肌m t D N A的损伤程度。结果显示，8-O H d G含量高原对照组与平原对照组相比，显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与高原对照组相比，显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与平原对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3心肌DNA聚合酶γ表达结果采用W ester n b l ot方法检测心肌组织D N A聚合酶γ含量，观察m t D N A的损伤修复情况。结果显示，D N A聚合酶γ的含量高原对照组与平原对照组相比，显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性药物组和佐木阿汤组与高原对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；D N A聚合酶γ的含量与平原对照组相比，有一定程度增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。

表1　心肌线粒体各指标表达结果（±s）

表1　心肌线粒体各指标表达结果（±s）

注：与平原对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与高原对照组比较，△表示P＜0.05。

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图1　DNA聚合酶γ蛋白表达结果

3　讨论

藏医学认为当人体的血液容量超过正常范围时会发生“多血症”“坏血病”，病位主要在肝，兼“木布”病证，相当于西医学之高原红细胞增多症［6］。2004年的国际高原病会议上通过了H APC的国际诊断指南，其诊断标准包括：红细胞≥6.5× 1012/L，血红蛋白≥200 g/L，红细胞压积≥65%，并且长期生活在海拔2 500m以上［7］。在高原地区（海拔3 000～4 700m），H APC的发病率为2.43%～37.5%，并且随着海拔的升高逐渐增多［8］，从平原移居至高原的人群的发病率高于常住居民，男性发病率高于女性［9-11］。

高原红细胞增多症临床上以血液学变化为特征，红细胞的过量增多会引起血液黏稠度增加，血流速度降低，进而加重血液缺氧情况［12］。同时心血管方面的改变也很突出，心肌损伤是其主要病理表现。心脏是机体代谢最旺盛的器官之一，对缺血缺氧十分敏感，较长时间严重缺血缺氧将导致心肌的损伤甚至坏死。安静时心肌摄氧率最高，应激时只有增加心肌血流量以满足心肌供氧量，急进高原时冠状血管血流量明显增加［13］，加之心肌泵血功能下降，心脏收缩间期延长，且患者的血液具有浓、黏、聚的特点［14］，导致患者机体微循环阻力增大，全身各器官血氧供给下降，加重低氧血症，形成恶性循环，加重心肌损伤。

线粒体是心肌缺血缺氧最敏感的细胞器，是细胞缺血缺氧损害的核心部位，其结构和功能的异常是心肌能量代谢障碍的主要表现［15-16］。线粒体的功能实现与m t D N A的结构和拷贝数有关。H APC患者m t D N A的数量较低，导致线粒体功能障碍，能量代谢发生异常，A T P生成不足，能量利用障碍，加重缺氧，进一步刺激R B C生成，形成恶性循环［17］。8-O H d G是D N A氧化损伤的标志性产物，检测心肌组织8-O H d G的含量，可判断心肌m t D N A的损伤程度，评价佐木阿汤保护心肌功能的作用［18］。本实验证实，H APC模型大鼠的m t D N A与平原对照组相比显著降低，8-O H d G含量显著升高，说明高原低压低氧环境对m t D N A造成了一定的损伤，而m t D N A的结构变异和拷贝数下降可能在H APC患者心功能损伤的发生、发展过程中起着重要作用。

m t D N A氧化损伤的修复主要靠线粒体碱基切除（m t B E R）途径，D N A聚合酶γ是m t B E R途径的关键，并且是迄今为止惟一被证实存在于脊椎动物线粒体的D N A聚合酶，对m t D N A的复制、合成与修复起着关键的作用［19］。线粒体D N A的复制过程由D N A聚合酶γ催化，一旦D N A聚合酶γ的结构发生变化，线粒体D N A的复制将受到影响。在其修复B E R途径中，被氧化或损伤的碱基由特定的脱嘌呤嘧啶核酸内切酶切割此位点5′的磷酸二酯主链，形成一段悬浮的脱氧核糖核酸片段，由D N A聚合酶γ来填充这一个碱基空隙，并由D N A连接酶封闭缺口，完成修复［20］。缺氧可降低D N A聚合酶γ的活性，使m t D N A修复途径受阻，拷贝数减少，线粒体功能障碍，进而加重缺氧［21］。本实验证实，H APC模型大鼠的m t D N A受到了损伤，而其D N A聚合酶γ与平原组相比却显著降低，因此不能及时对m t D N A进行修复，更加重了心肌线粒体的损伤。

佐木阿汤是藏医治疗多血症的经典方，最早记载于14世纪的藏医典籍《藏医千万舍利》中［22］，由5味藏药组成，它通过清血火、调理血液黏稠度，消除肝火盛的作用达到治疗多血症的目的。其中，藏锦鸡儿有消血栓、清血火、改善血液循环的作用，可缓解多血症的血液黏稠和肝火亢盛引起的头痛、头晕、口干、静脉曲张问题；巴夏嘎具有清血火的作用，是针对本病病理性质和部位的；兔耳草、儿茶和矮紫堇共同具有消除血量增多，治火亢的作用，可消除口唇发紫、眼部充血等症；矮紫堇可治木布病证，消除血热证症状，防止多血症引发的重症疾病的发生和发展。

本实验结果表明，佐木阿汤干预H APC模型大鼠后，心肌m t D N A与D N A聚合酶γ都有显著性增多，损伤产物8-O H d G显著性降低，证明佐木阿汤可以促进线粒体D N A损伤的修复，从而使心肌线粒体的结构和功能逐渐恢复正常，改善H APC模型大鼠心肌的缺血缺氧状态。

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Influenceof Tibetan M edicine ZuoMuA Tang on M yocardialm tDNA ofHAPC RatModel

LU Mengqian1，NIMA Ciren2，YU Tianyuan1△，XIAN Sitong1，DUOJIE Renqing2，PAN Fan1，BASANG Deji3，ZHANG Linfeng1，CHEN Guoyong1，WU Jiancong4
1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2 Tibetan TraditionalMedical College；3 Tibet Autonomous Region Academy of Tibetan Medicine；4 Beijing Massage Hospital

Objective：To explore themechanism of ZuoMuA Tang protecting myocardialmitochondria by observing its influence on the expressions ofmitochondria DNA（m tDNA）and DNA polymeraseγinmyocardial cells of ratmodelw ith high altitude polycythemia（HAPC）.Methods：Thirty-two ratswere random ized into plain control group，plateau control group，positivemedicine group and ZuoMuA Tang group.Except the rats in plain controlgroup，other ratswere kept in Lhasa to prepare HAPCmodels，and intervened by intragastric adm inistration of physiologicalsaline，HongJingTian（Rhodiola rosea L.）and ZuoMuA Tang after feeding in onemonths，the tissues were taken after intervened in threemonths，the contentsofmyocardialm tDNA，8-OHdG and DNA polymeraseγof the rats were detected respectively by adopting Realtime PCR，ELISA and Western blotmethod.Results：The contentsofm tDNA decreased notablywhen plateau controlgroup was compared w ith plain controlgroup（P＜0.05）；they raised obviously when positivemedicine group was compared w ith ZuoMuA Tang group and plateau control group（P＜0.05）；but therewas the differencewhen positivemedicine group was compared w ith plain controlgroup （P＜0.05）.The levelsof8-OHdG rose significantlywhen plateau controlgroupwascompared w ith plain controlgroup （P＜0.05）；they lowered when positivemedicine group was compared w ith ZuoMuA Tang group and plateau control group（P＜0.05）；therewas no obvious differencewhen positivemedicine group was compared w ith ZuoMuA Tang group and plain control group（P＜0.05）.The contents of DNA polymeraseγdecreased evidently when plateau control group was compared w ith plain control group（P＜0.05）；there was no obvious difference when positive medicine group and ZuoMuA Tang group were compared w ith plateau control group（P＞0.05）；it rose indistinctly when positive medicine group and ZuoMuA Tang group were compared w ith plain control group（P＞0.05）. Conclusion：The levels of myocardialm tDNA and DNA polymeraseγimproved significantly，and the levels of damage product 8-OHdG decreased obviously after intervened HAPC ratmodel by ZuoMuA Tang.ZuoMuA Tang could promote the recovery of m tDNA damage，therefore to make the structure and the functions ofmyocardial m itochondria restore to normal，and improve ischem ic and hypoxia state of HAPC ratmodel.

high altitude polycythemia；animalexperiments；rats；ZuoMuA Tang；m itochondria DNA；myocardium

R285.5

A

1004-6852（2016）04-0010-04

2015-11-09

国家自然科学基金项目（编号81260567）。

鲁梦倩（1987—），女，博士研究生。研究方向：针灸推拿治疗周围神经损伤的机理研究。

于天源（1965—），男，博士学位，教授。研究方向：针灸推拿治疗周围神经损伤的机理研究。