纹党参多糖联合环磷酰胺对S180荷瘤小鼠抗肿瘤增效机制的研究*

吴红梅，苟于强，胡林海，胡芳弟，陈嘉屿，杨春霞，白瑞斌甘肃省中医学校，甘肃 兰州 7000；兰州军区疾病预防控制中心；嘉峪关市第一人民医院；兰州大学药学院；兰州军区兰州总医院消化科

纹党参多糖联合环磷酰胺对S180荷瘤小鼠抗肿瘤增效机制的研究*

吴红梅1，苟于强2，胡林海3，胡芳弟4△，陈嘉屿5，杨春霞4，白瑞斌4
1甘肃省中医学校，甘肃 兰州 730050；2兰州军区疾病预防控制中心；3嘉峪关市第一人民医院；4兰州大学药学院；5兰州军区兰州总医院消化科

目的：研究纹党参多糖对环磷酰胺抗肿瘤作用的增效效应及作用机制。方法：选用健康成年昆明种小鼠135只，随机分为9组：正常对照组（ZD组），荷瘤对照组（HD组），环磷酰胺组（CP组），纹党参多糖高（WCPP-G组）、中（WCPP-Z组）、低（WCPP-D组）剂量治疗组及WCPP-G、WCPP-Z、WCPP-D联合CP组，每组15只。除ZD组小鼠外，将0.2mL（1×1010个/L）肿瘤细胞接种于各组小鼠腋窝皮下。ZD组和HD组给予0.5mL生理盐水灌胃，6小时后给予等体积蒸馏水，1次/d；CP组0.5mL生理盐水灌胃，6小时后腹腔注射环磷酰胺20mg/（kg·d）；WCPP-G、WCPP-Z、WCP-D组分别给予高［400mg/（kg·d）］、中［200mg/（kg·d）］、低［100mg/（kg·d）］浓度0.5mL党参多糖水溶液灌胃，6小时后腹腔注射0.5mL生理盐水；WCPP-G、WCPP-Z、WCP-D联合CP组分别给予高、中、低浓度0.5mL党参多糖水溶液灌胃，6小时后腹腔注射环磷酰胺20mg/（kg·d）。20天后计算抑瘤率，测定免疫相关指标及血清细胞因子IL-2、IL-6、IL-1β、IL-4、INF-γ、TNF-α的含量。结果：与ZD组比较，HD组IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ水平下降，其中TNF-α变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），其余各项变化明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。与HD组比较，CP组IL-2、IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α水平降低，其中INF-γ、IL-2水平变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），其余各项变化明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-2、IL-6、IL-1β、IL-4、TNF-α、INF-γ水平各剂量WCPP组及其联合CP组均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与HD组及CP组比较，WCPP-G、Z组及各剂量WCPP联合CP组IL-2、IL-6水平变化明显差异有统计学意义（P＜0.05），各剂量WCPP组及其联合CP组IL-1β和TNF-α水平均有明显变化，差异有统计学意义（P＜0.05）。与CP组比较，WCPP-D组IL-2水平变化明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；WCPP-Z、WCPP-D组IL-4水平变化明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。与HD组比较，各剂量WCPP组及其联合CP组IL-4和INF-γ水平变化明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。WCPP各组的抑瘤率均低于CP组；WCPP-G、WCPP-Z、WCP-D+CP组的抑瘤率高于CP组。结论：纹党参多糖能增强环磷酰胺的抗小鼠S180肿瘤作用，这可能与其能提高荷瘤小鼠外周血IL-2水平，降低IL-4水平逆转Th1/Th2漂移，促进免疫细胞的活化和增殖，激活免疫细胞对瘤细胞的特异性和非特异性杀伤有关。

纹党参多糖；环磷酰胺；抗肿瘤；增效

恶性肿瘤的化学疗法、放射疗法及手术疗法均存在较大的免疫功能抑制和损伤作用。大量抗肿瘤化学药物的临床应用，使肿瘤患者的生存率得到了提高，但生存质量明显下降。近年来，如何提高患者生存质量，减少化疗的副作用受到国内外学者的重视［1］。化疗药物联合中药特别是旨在实现增效减毒作用的中药多糖制剂治疗恶性肿瘤受到广泛关注［2-4］。获国家“地理标志产品保护认证”［5］的甘肃纹党有显著的抗肿瘤活性及提高免疫功能的作用［6-8］。笔者旨在研究纹党参多糖对环磷酰胺抗肿瘤的协同增效作用，分析其对环磷酰胺抗肿瘤协同作用的机理，为纹党参多糖对化疗药协同增效作用提供理论依据，为其综合开发利用提供药效学支持。

1　材料与方法

1.1材料昆明种4～6周龄小鼠135只，体质量（20±2）g，雌雄各半，由兰州大学实验动物中心提供（合格证号12-4-5）。S180腹水型瘤株由兰州大学基础医学院药理教研室提供；环磷酰胺注射液（C Y）（江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号：20120308）。纹党参多糖，根据文献［9］方法制备，并经过脱色素除蛋白处理后，经酚硫酸法测定，多糖含量达70%。小鼠I L-2、I L-6、I L-1β、I L-4、I NF-γ、TNF-αE L A S I A吸附反应试剂盒购自达科为生物技术有限公司。

1.2仪器Bi o-R ad 680型酶标仪（日本伯乐公司提供），凤凰牌倒置显微镜（江西凤凰光学控股有限公司提供），S W-C J-1D型超净工作台（苏州净化设备有限责任公司提供），M e mm er t型二氧化碳培养箱（北京五洲东方科技发展有限公司提供），F A2004分析电子天平（上海良平仪器仪表有限公司提供）。

1.3方法

1.3.1动物分组及给药健康成年昆明种小鼠135只，随机分为9组：正常对照组（Z D），荷瘤对照组（H D），环磷酰胺组（CP），纹党参多糖高（W CPP-G）、中（W CPP-Z）、低（W CP-D）剂量治疗组，纹党参多糖高、中、低剂量+环磷酰胺治疗组，每组15只。除Z D组小鼠外，将0.2mL（1×1010/L）肿瘤细胞接种于各组小鼠腋窝皮下。Z D组和H D组给予0.5mL生理盐水灌胃，6小时后给等体积蒸馏水，1次/d；CP组给0.5mL生理盐水灌胃，6小时后腹腔注射环磷酰胺 20 mg/（k g·d）；W CPP-G、W CPP-Z、W CP-D组分别给予高［400mg/（k g·d）］、中［200mg/（k g·d）］、低［100mg/（k g·d）］浓度0.5mL党参多糖水溶液灌胃，6小时后腹腔注射0.5mL生理盐水；W CPP-G、W CPP-Z、W CP-D+CP组分别给予高、中、低浓度0.5mL党参多糖水溶液灌胃，6小时后腹腔注射环磷酰胺20mg/（k g·d），共20天。末次给药次日，称取小鼠质量，摘眼球取血，收集血液后，3 500 r/m i n离心10分钟，吸取上层血清，-20℃备用。颈椎脱臼处死，迅速取出小鼠肝、脾及胸腺，剥离肿瘤组织，滤纸吸干后迅速称质量。

1.3.2荷瘤小鼠的肿瘤抑制率公式计算抑瘤率。纹党参多糖和环磷酰胺的协同增效作用根据q值进行评价。其中EA为党参多糖的抑瘤率，E B为环磷酰胺药的抑瘤率，EA B为两药合用时的抑瘤率，当q=0.85～1.25为两药相加，q＞1.25为两药增强（或协同），q＜0.85为两药拮抗［10］。

1.3.3荷瘤小鼠免疫器官的变化计算各组胸腺指数（Th y m u s i n de x，T I）、脾指数（S p l ee n i nde x，S I）和肝脏指数（L i v er i n de x，L I）。公式：脏器指数=平均脏器质量（g）/平均体质量（g）。

1.3.4荷瘤小鼠血清IL-2、IL-6、IL-1β、IL-4、INF-γ、TNF-α含量取小鼠血清，采用酶标仪以E L I S A方法检测I L-2、I L-6、I L-1β、I L-4、I NF-γ、TNF-α水平。

1.4统计学方法数据采用S P SS 16.0进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，样本比较采用方差检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

小鼠荷瘤过程中，H D组死亡2只，CP组死亡2只，造模失败1只，W CPP-G、W CPP-Z、W CP-D组无死亡，造模失败6只（W CPP-G组3只，W CPP-Z组2只，W CP-D组1只），W CPP-G、W CPP-Z、W CP-D+CP组各死亡1只，W CPP-G、W CPP-Z+CP组各造模失败1只。119只进入实验。整个荷瘤过程中，H D组出现明显生理异常，表现为精神不振、食欲差、畏寒扎堆、体毛稀疏且干涩、行动迟缓，个别出现肉瘤破溃、腹水形成；CP组和W CPP各组小鼠状况较好，个别有少毛、脱毛、精神不振、懒于活动等情况，无肉瘤破溃及腹水形成；W CPP+CP各组小鼠活动状态良好，毛色及精神均好于其他各组。W CPP各组1次注射S180瘤株不能成功染瘤的动物数量高于其他组，提示纹党参多糖可能有预防实验动物染瘤作用。

2.1瘤体和肿瘤抑制率与H D组比较，CP组、W CP-D、W CPP-Z、W CPP-G组及W CP-D、W CPP-Z、W CPPG+CP组瘤体较小差异有统计学意义（P＜0.05）；W CPP+CP各组瘤体质量小于各W CPP组和CP组，差异有统计学意义（P＜0.05）。W CP-D、W CPP-Z、W CPP-G+CP各组q值分别为0.90、1.10、0.94，数值均大于0.85，提示不同剂量的纹党参多糖均能增强环磷酰胺的抗小鼠S180肿瘤的作用。W CP-D、W CPP-Z、W CPP-G+CP各组及W CPP-D、W CPP-Z、W CPP-G各组的抑瘤率分别为73.77%、76.10%、77.14%和43.09%、46.03%、66.52%。可见各剂量组对S180瘤的生长抑制作用有剂量依赖性。见表1。

表1　党参多糖对环磷酰胺抗S180肿瘤效应的增强作用

2.2免疫器官CP组荷瘤小鼠胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数明显下降，与H D组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。各剂量W CPP组及其联合CP组荷瘤小鼠胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数均增高（P＜0.05）；肝脏指数各剂量W CPP组和W CPPD+CP组与环磷酰胺组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组变化明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；肝脏指数及W CPP-Z和W CPP-G联合CP组脾脏指数各剂量W CPP组及其联合CP各组与H D组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3血清IL-2、IL-6、IL-1β、IL-4、INF-γ、TNF-α含量H D组I L-2、I L-6、TNF-α、I NF-γ水平明显下降（P＜0.05），与Z D组比较，TNF-α水平下降不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），其余各项变化明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。与H D组比较，CP组I L-2、I L-1β、I L-6、I L-4、TNF-α水平降低，其中I NF-γ、I L-2水平变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），其余均有明显变化，差异有统计学意义（P＜0.05）。I L-2、I L-6、I L-1β、I L-4、TNF-α、I NF-γ水平各剂量W CPP组及其联合CP组均显著增高（P＜0.05）。其中W CPP-Z组、W CPP-G组及各剂量W CPP联合CP组与H D组及CP组比较，I L-2、I L-6水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；W CPP-D I L-2与CP组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；I L-1β和TNF-α水平各剂量W CPP组及其联合CP组与H D组及CP组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；I L-4水平变化 W CPP-D、W CPP-Z组与H D组及CP组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；I L-4和I NF-γ水平各剂量W CPP组及其联合CP组与H D组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　对S180荷瘤小鼠血清IL-2、IL-6、IL-1β、IL-4、TNF-α、INF-γ含量的影响（±s）　pg/mL

表2　对S180荷瘤小鼠血清IL-2、IL-6、IL-1β、IL-4、TNF-α、INF-γ含量的影响（±s）　pg/mL

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与环磷酰胺组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01。

组别　IL-2　IL-1β　IL-6　IL-4　TNF-α　INF-γ ZD组　21.33±7.83*#　132.12±34.17*　30.79±4.27*#　1.41±0.29#　15.35±1.27#　0.75±0.03*#HD组　15.14±4.22　182.11±23.14　26.34±3.12　1.71±0.82　13.17±1.12　0.36±0.02 CP组　14.34±4.26　144.87±33.43*　23.11±3.27*　0.11±0.07**　10.41±0.96*　0.54±0.07*WCPP-D组　18.15±2.37#　180.19±44.15*#　27.10±4.25　0.57±0.06*#　15.10±1.25*#　0.64±0.25*WCPP-Z组　20.73±4.61**##　205.26±55.54*#　34.16±5.21*#　0.39±0.05*#　16.12±1.23*#　0.69±0.36*WCPP-G组　24.69±5.89**##　206.18±48.63*#　51.35±8.23*#　0.53±0.03*　19.44±1.11*#　0.59±0.79*WCPP-D+CP　24.35±3.17**##　250.63±38.30*#　56.37±8.10*#　0.22±0.02*　21.33±2.01*#　0.66±0.64*WCPP-Z+CP组　29.42±5.11**##　259.19±56.88*#　59.39±6.71*#　0.21±0.03*　21.24±2.16*#　0.59±0.78*WCPP-G+CP组　30.43±3.92**##　270.18±48.74*#　60.11±8.96*#　0.29±0.08*　24.19±1.91*#　0.62±0.86*

3　讨论

肿瘤的发生、发展与机体免疫功能密切相关，机体发生肿瘤时免疫功能抑制［11-13］。环磷酰胺为临床广泛应用的抗癌药物，对恶性肿瘤有一定的疗效，但胃肠道反应、骨髓和免疫功能抑制明显，使患者的耐受性下降，甚至被迫中断治疗。

T细胞介导的免疫应答在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。Th细胞分为Th1和Th2两个亚型。Th1细胞主要分泌I L-2和I FN-γ，Th2细胞则以分泌I L-4、I L-5为特征。正常生理情况下，Th1/Th2细胞处于动态平衡状态。机体生理功能异常，Th l/Th2动态失衡，人体细胞因子网络紊乱，可引起多种疾病的发生、发展。在机体抗肿瘤免疫反应中，Th1细胞主导的细胞免疫功能对抗肿瘤免疫反应有非常重要的作用，当细胞平衡由Th1向Th2漂移时，Th2优势状态可引起肿瘤免疫逃逸［14］，机体的抗肿瘤免疫受到严重干扰。I L-2是机体内最重要、最强有力的T细胞生长因子，由活化的Th1细胞经刺激后产生，具有广泛的生物活性。I L-2可促进T细胞转化，加强T淋巴细胞增殖，增强T细胞的杀伤活性，激活B细胞及单核巨噬细胞产生I L-1、I L-6、TNF-α、TNF-β及I NF-γ，发挥免疫功能，放大免疫效应［3］。

本实验结果表明，纹党参多糖的抑瘤率低于环磷酰胺，但对胸腺、脾脏和肝脏指数均有增重作用；纹党参多糖联合环磷酰胺对胸腺、脾脏和肝脏指数均亦有增重作用，但弱于单用纹党参多糖；纹党参多糖及纹党参多糖联合环磷酰胺均显著增加荷瘤小鼠外周血I L-2、I L-1β、I L-6、I NF-γ及TNF-α水平，I L-4含量明显降低；党参多糖联合环磷酰胺的作用优于单用纹党参多糖。说明纹党参多糖与环磷酰胺具有良好的增效减毒作用，通过增重免疫器官，提高荷瘤小鼠外周血I L-2水平，降低I L-4水平来逆转Th1/Th2漂移，平衡机体细胞因子网络，刺激免疫细胞活化和增殖，激活免疫细胞对瘤细胞的特异性和非特异性杀伤，增强抑瘤率，改善化疗药物对机体的损伤。在荷瘤过程中，纹党参多糖组无死亡，纹党参多糖联合环磷酰胺组各死亡1只，均小于荷瘤对照组和环磷酰胺组，表明纹党参多糖可能有预防实验动物染瘤功效，有待于进一步证实。

纹党参为素花正品，属于补益类中药，甘肃产纹党参多糖含量高，产量大，是党参中的优良品种，对甘肃纹党参多糖的研究有望为甘肃党参的开发利用提供理论依据。

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Study on Synergetic Mechanism of Polysaccharide Extracted from WenXian DangShen Com bined w ith Cyclophospham ide in Fighting against S180Tum or of theM ice

WU Hongmei1，GOU Yuqiang2，HU Linhai3，HU Fangdi4△，CHEN Jiayu5，YANG Chunxia4，BAIRuibin4
1 Gansu Provincial TCM School，Lanzhou 730050，China；2 Lanzhou Military Region Center for Disease Control and Prevention；3 Jiayuguan Municipality the First People′s Hospital；4 Pharmacy College of Lanzhou University；5 Gastroenterology Department of Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command

Objective：To study the synergy between the polysaccharide extracted from WenXian DangShen ［Codonopsis pilosula.Var.modesta（Nannf）L.T.shen］and cyclophospham ide fighting against tumor and itsmechanism.Methods：All135micewere randomized into nine groups：normal controlgroup（ZD group），cancer-bearing controlgroup（HD group），cyclophospham ide group（CPgroup），the treatmentgroupsofhigh（WCPP-G group），mod-erate（WCPP-Z group）and low（WCPP-D group）dosesof the polysaccharide extracted from WenXian DangShen，and WCPP-G，WCPP-Z and WCPP-D combined w ith CP groups，15 mice each group.Except them ice in ZD group，0.2mL（1×1010/L）tumor cellswere transplanted under the skin of the armpitof them ice in differentgroups.ZD group and HD groupswere given w ith intragastric adm inistration of 0.5m L physiological saline，and the distilled water in the same amount in six hours，once per day；CP group accepted intragastric adm inistration of 0.5m L physiological saline，and peritoneal injection of cyclophosphamide 20mg/（kg·d）in six hours；WCPP-G，WCPP-Z andWWCP-D groups accepted intragastric adm inistration of polysaccharide aqueous solution in high［400mg/（kg·d）］，moderate ［200mg/（kg·d）］and low［100mg/（kg·d）］concentrations，and peritoneal injection of 0.5m L physiological saline in six hours；WCPP-G，WCPP-Z and WWCP-D combined w ith CPgroups received 0.5m L polysaccharide aqueous solution in high，moderate and low concentrations by lavage respectively，and peritoneal injection of cyclophosphamide 20mg/（kg·d）in six hours；tumor inhibition ratewas calculated in 20 days，the contentsof immune-related indexes，serum cytokines including IL-2，IL-6，IL-1β，IL-4，INF-γand TNF-αwere detected.Results：Compared w ith ZD group，the levelsof IL-2，IL-6，INF-γand TNF-αdecreased，while the changesof TNF-αchanged indistinctly in HD group（P＞0.05），and others changed evidently（P＜0.05）.Compared w ith HD group，the levelsof IL-2，IL-1β，IL-6，IL-4 and TNF-αlowered in CPgroup，while the levels of INF-γand IL-2 changed insignificantly（P＞0.05），others changesobviously（P＜0.05）；the levelsof IL-2，IL-6，IL-1β，IL-4，TNF-αand INF-γrose evidently inWCPP groups in differentdosesand WCPP combinew ith CPgroups（P＜0.05）.Compared w ith HD group and CPgroup，the levelsof IL-2 and IL-6 changed significantly inWCPP-G，Z group and WCPP combined w ith CPgroups in differentdoses（P＜0.05）.The levelsof IL-1βand TNF-αshowed obvious changes inWCPPgroups in differentdoses and WCPP combined with CPgroups（P＜0.05）.Compared with CPgroup，the levels of IL-2 changed notably in WCPP-D group（P＜0.05）；the levels of IL-4 changed notably in WCPP-Z and WCPP-D groups（P＜0.05）.Compared w ith HD group，the levels of IL-4 and INF-γchanged apparently in WCPP groups in different doses and WCPP combined w ith CP groups（P＜0.05）.WCPP groups were lower than CP group in tumor inhibition rate；WCPP-G，WCPP-Z and WCPP-D groups were higher than CP group in tumor inhibition rate.Conclusion：The polysaccharide extracted from WenXian DangShen could enhance anti-tumor effects of cyclophosphamide of the m ice，whichm ightbe related to improving the levels of IL-2 in peripheral blood of tumor-bearingmice，decreasing the levels of IL-4 to reverse Th1/Th2 shifting，promoting the activation and proliferation of immunological cells，arousing immunologicalcells'specific and nonspecific killings to tumor cells.

the polysaccharideextracted from WenXian DangShen；cyclophosphamide；anti-tumor；synergy

R285.5

A

1004-6852（2016）04-0017-05

2015-12-21

甘肃省自然科学基金资助项目（编号1308RJZA101）；甘肃省中医药科学技术研究资助项目（编号GZK-2011-73）。

吴红梅（1965—），女，硕士研究生，副主任医师，高级讲师。研究方向：中西医结合临床研究。

胡芳弟（1971—），女，教授。研究方向：中药化学分析。