miRNA-200b通过靶向VEGF抑制视网膜母细胞瘤细胞生长与侵袭

刘越峰　罗卫民　张勇　钟晓东



·基础研究论著·

miRNA-200b通过靶向VEGF抑制视网膜母细胞瘤细胞生长与侵袭

刘越峰罗卫民张勇钟晓东

目的明确miRNA-200b是否通过调控靶向血管内皮生长因子(VEGF)的表达而抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长与侵袭，进一步揭示miRNA-200b抗肿瘤的分子机制。方法将视网膜母细胞瘤Y79细胞分成6组：miRNA-200b、miRNA-NC、sh-VEGF、shRNA-NC、miRNA-200b+sh-VEGF、miRNA-NC+shRNA-NC组。荧光素酶报告系统检测miR-200b对VEGF的3’-非翻译区荧光素酶活性的影响；蛋白免疫印迹法检测sh-VEGF转染的干扰效果；MTS实验与Transwell侵袭实验分别检测上述各组对视网膜母细胞瘤细胞增殖与侵袭的影响。结果荧光素酶报告检测结果显示，miR-200b能特异性地与VEGF的3’-非翻译区结合，并抑制其荧光素酶的活性；蛋白免疫印迹法显示，sh-VEGF转染组中VEGF的蛋白表达水平较对照组明显下调；MTS实验结果显示，转染miRNA-200b 组与sh-VEGF组48 h后视网膜母细胞瘤细胞的生存率均低于各自对照组(P均<0.05)；而共转染miRNA-200b+sh-VEGF组 48 h后视网膜母细胞瘤细胞的生存率低于对照组、miRNA-200b组、sh-VEGF组(F=9.887,P均<0.05)；Transwell侵袭实验显示，转染miRNA-200b组与sh-VEGF组48 h后视网膜母细胞瘤细胞的穿膜能力均低于各自对照组(P均<0.05)；而共转染miRNA-200b+sh-VEGF组 48 h后视网膜母细胞瘤细胞的穿膜能力低于对照组、miRNA-200b组、sh-VEGF组(P均<0.05)。结论miRNA-200b通过靶向调控VEGF的表达而抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长与侵袭。

视网膜母细胞瘤；微小RNA-200b；血管内皮生长因子生长；侵袭

视网膜母细胞瘤的治疗目的以根治肿瘤和保护有效视力为主，但是一些放射治疗和化学治疗的方式可能引起干眼病、视神经病变、视网膜病变、白内障或继发于眼眶发育不良的面部畸型等病症，眼球的摘除术会使病人永久性的丧失患侧视力；而继发的肿瘤及视网膜母细胞瘤的转移更是致命性的，因此现有的治疗效果常常是有限的[1]。基因治疗的发展也为视网膜母细胞瘤的治疗提供了新的方法，可避免彻底地眼球摘除或放化疗等带来的继发疾病，因此有效作用靶点的寻找也成为了一个热点。

微小RNA(miRNA)为内源性的非编码小分子RNA，在转录后水平对表达进行负调控，包括个体发育、细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡等多方面。研究表明，miRNA-200b与多种肿瘤的生长增殖及复发转移等密切相关，如胃癌、乳腺癌、胶质瘤等[2-4]。血管内皮生长因子(VEGF)为一种内皮细胞特异的有丝分裂原，高表达的VEGF不仅可促进肿瘤的血管新生，且与肿瘤的浸润及转移有密切关系。VEGF的高表达意味着肿瘤的远处转移及复发的危险性增强，术后的生存期下降[5]。VEGF也可减低小鼠足细胞的黏附性，激活PI3K/Akt信号通路[6]。本研究中，我们拟证实miRNA-200b可通过靶向调控VEGF蛋白的表达而抑制视网膜母细胞瘤细胞生长与侵袭，并进一步探讨miRNA-200b在视网膜母细胞瘤中的抑瘤功能及内在分子机制。

材料与方法

一、主要材料

miRNA-200b 模拟物(miRNA-200b)及无关序列对照(miRNA-NC)从美国Ambion公司购买，miRNA-200b 模拟物序列为，5’-TCATCATTACCAGGCAGTATTA-3’，miRNA-NC序列为 5’-AATGGAACGATACAGAGTAGATT-3’， VEGF Short Hairpin RNA(shRNA) Lentiviral Particles (Human, sc-108080)重组载体pRFP-C-RS(VEGF shRNA)及其对照为shRNA-NC，鼠单抗人VEGF和鼠单抗GAPDH购买于美国Santa cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗购买于武汉博士德公司。pcDNA 3.1-VEGF重组载体(A DNA sequence encoding the mature form of human VEGF)、VEGF、pcDNA3.1空载体对照(vector)、突变型VEGF的3’-非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)的荧光素酶报告载体(VEGF-mut)和野生型VEGF的3’-UTR的荧光素酶报告载体(VEGF-wt)由广州市复能基因公司成功构建。双荧光素酶活性检测试剂盒购买于美国Promega公司，Lipofectamine 2000转染试剂和Trizol购买于美国Invitrogen公司。PRIM1640和Opti-MEM培养基以及胎牛血清购买于美国Gibco公司。MTS细胞生长增殖/毒性检测试剂盒购买于美国Sigma公司。人视网膜母细胞瘤Y79细胞购买于中科院上海生化细胞研究所。蛋白提取试剂盒购买于上海 BestBio 贝博生物公司。BCA和增强化学发光(Enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒购买于美国Pierce公司，Transwell小室及基质胶等相关试剂购买于美国BD公司。

二、细胞培养

人视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞培养于含 10% 胎牛血清(FBS)，1%青霉素-链霉素溶液和2 mmol/L的谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中，在37℃、5% CO2的细胞培养箱内。Y79细胞培养时呈单层贴壁生长，细胞汇合度达到80%～90%时，倾弃培养液，用PBS洗3遍，随后用0.25% 胰酶消化，在显微镜下观察见细胞间隙增大后，随即倾弃胰酶，加入含10% FBS的RPMI-1640培养基，并吹打细胞使其成单细胞悬液，常规传代。

三、瞬时转染miRNA和质粒

收集培养瓶中预先培养至约80%左右密度的细胞，用含10% FBS的RPMI-1640培养液稀释，吹打制成5×104细胞/ml的单细胞悬液，按2 ml/孔铺至6孔板中，100 μl/孔铺至96孔板中，并放置在5% CO2、37℃的细胞培养箱中，待细胞密度达60%～80%时用于转染。接种细胞于6孔或96孔板中，待完全培养基中细胞生长至30%～50%密度时，在无菌EP管中配好Lipofectamin 2000及待转染试剂；室温放置20 min，使脂质体与DNA形成复合体；用无血清培养液洗涤培养瓶中的细胞。然后向复合体中加入无血清培养液(不含抗生素)，温和地混匀，加入到待转染的6或96孔板中；置于37°C、5%CO2培养箱中，48 h后，收集细胞并抽提蛋白。

四、荧光素酶活性检测miRNA-200b是否与VEGF的3-UTR区结合

将实验分成4组：miRNA-200b+VEGF-wt、miRNA-NC+VEGF-wt、miRNA-200b+VEGF-mut、miRNA-NC+VEGF-mut。分别共转染上述4组于Y79细胞48 h后，收获细胞。按荧光素酶活性检测试剂盒(美国Promega公司)的说明书用单光子检测仪(美国Biorad公司)检测细胞荧光素酶的活性。计算相对荧光素酶活性，公式为萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值，每组实验重复3次。

五、蛋白免疫印迹法检测Y79细胞中VEGF蛋白表达改变

将实验分2组：miRNA-200b与miRNA-NC、VEGF与vector。分别转染上述各组于Y79细胞48 h后，提取各组细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度。每孔分别取30 μg样本，进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，5%胎牛血清白蛋白室温封闭1 h，加入1∶200鼠抗人VEGF抗体或1∶1 000鼠抗人GAPDH抗体，4℃过夜。TBST洗膜30 min，加入1∶10 000辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗，并且室温孵育1～1.5 h，TBST洗膜30 min后加入ECL发光剂，X片曝光、显影、定影。扫描条带后获取并保存图片。Quantity One软件分析，以目的蛋白质条带的灰度值和内参GADPH的 蛋白灰度值比值来表示目的蛋白的相对表达水平，每组实验均重复3次。

六、MTS法检测miRNA-200b mimics和VEGF对Y79细胞生长增殖活性的影响

将实验分成6组：miRNA-200b、miRNA-NC、sh-VEGF、shRNA-NC、miRNA-200b+sh-VEGF、mi-RNA-NC+shRNA-NC。分别转染Y79细胞，每组设置6个复孔，在未接种细胞的孔中加入RPMI-1640培养基来作为调零孔。转染后放置于37℃、5% CO2培养箱，培养48 h。每孔加入20 μl MTS检测试剂，37℃孵育2 h后，每孔中加入150 μl DMSO，低速振荡10 min至使结晶物充分融解。随后用酶标仪测定492 nm波长的吸光度值(OD492)。增殖活性计算公式为：(处理组-调零孔)/(对照组比-调零孔)×100%，每组实验重复3次。先转染好细胞，然后把转染好的细胞消化并接种到96孔板，接种后再培养48 h。

七、Transwell侵袭实验

在Transwell小室中铺加基质胶稀释液，放置过夜使其成膜。次日取100 μl细胞稀释液接种于小室的上腔，下腔中加入500 μl含10%胎牛血清的培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养36 h后，取出并擦弃小室上层的细胞，并用甲醛固定，0.1%结晶紫染色。PBS缓冲液清洗，倒置并晾干。在光学显微镜下观察，并随机选取4个高倍视野进行细胞计数，并取平均值。

八、统计学处理

结　　果

一、VEGF为miRNA-200b直接调控的靶基因

通过TargetScan在线软件预测，VEGF为miRNA-200b预测的靶基因；随后将miRNA-200b和miRNA-NC分别共转染到VEGF-wt与VEGF-mut两组中，采用单光子检测荧光素酶活性。结果表明miRNA-200b在VEGF-mut和VEGF-wt组中荧光素酶活性强度分别为(0.974±0.091，0.543±0.062)，两者比较差异有统计学意义(t=3.876, P=0.018)；而miRNA-NC在VEGF-mut和VEGF-wt组的活性强度分别为(0.921±0.116，0.861±0.083)，两者比较差异无统计学意义(t=0.421, P=0.695)，见图1。

二、过表达miRNA-200b和下调VEGF表达抑制视网膜母细胞瘤细胞生长增殖

为验证miRNA-200b对视网膜母细胞瘤细胞的生长增殖的影响，分别转染sh-VEGF(100 nmol/L)和对照组(shRNA-NC)到Y79细胞中，蛋白免疫印迹法检测干扰效果，结果表明sh-VEGF组(OD=0.547±0.041)中VEGF蛋白表达低于shRNA-NC组(OD=1.063±0.148)，2组比较差异有统计学意义(t=4.831, P=0.014，见图2A)。

MTS法结果表明(图2B)，转染miRNA-200b 组Y79细胞的生存率(56±6%)低于miRNA-NC组(97±5%)，差异有统计学意义(t=5.379, P=0.005)；转染sh-VEGF 组Y79细胞的生存率(55±4%)低于shRNA-NC组(95±7%)，差异有统计学意义(t=4.850, P=0.008，图2B)；而共转染miRNA-200b+sh-VEGF组Y79细胞的生存率(31±4%)低于对照组、miRNA-200b组、sh-VEGF组，差异有统计学意义(F=9.887, P<0.05)。即过表达miRNA-200b和下调VEGF的表达均能抑制视网膜母细胞瘤细胞生长增殖，且过表达miRNA-200b和下调VEGF的表达具有协同作用。

图1　miRNA-200b的靶基因预测及荧光素酶报告载系统验证图

A：VEGF的基因3'非编码区(UTR)上含有一个miRNA-200b的结合位点； B：荧光素酶报告载系统检测miRNA-200b对VEGF 3’UTR的荧光酶活性的影响；*P<0.05

图2　MTS法检测过表达miRNA-200b对Y79细胞增殖能力的作用

A：蛋白免疫印迹法检测sh-VEGF转染的干扰效果；B：各转染组Y79细胞生存率的统计分析，与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

三、miRNA-200b通过靶向VEGF抑制Y79细胞的侵袭能力

Transwell结果表明，转染miRNA-200b组穿出基底膜细胞数为(95±10)，低于miRNA-NC组(168±6，t=5.667, P=0.004)；转染sh-VEGF组穿出基底膜细胞数为(84±6.2)，低于shRNA-NC组(164±13，t=5.578, P=0.005)；而共转染miRNA-200b+sh-VEGF组穿出基底膜细胞数为(51±5)，低于对照组、miRNA-200b组、sh-VEGF组，差异有统计学意义(F=8.607, P=0.001)，见图3。表明过表达miRNA-200b或下调VEGF的表达均能抑制视网膜母细胞瘤细胞侵袭，且过表达miRNA-200b与下调VEGF的表达具有协同作用。

图 3　Transwell侵袭实验检测过表达miRNA-200b对Y79细胞侵袭能力的作用

A：穿过基底膜的Y79细胞显微照片(×200) ；B：各转染组Y79细胞穿出数量的统计分析，与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

讨　　论

视网膜母细胞瘤是一种常见于儿童及新生儿的视网膜恶性肿瘤，在美国5岁以下的儿童该病的发病率达1/18 000，且发展十分迅速，在南美及中美地区和发展中国家，发病率及死亡率更高[7]。视网膜母细胞瘤有遗传和非遗传型之分，遗传型为常染色体显性遗传，多数双眼发病，发病早且易转移而致死；后者的基因突变仅发生在视网膜细胞，常见于单侧或散发型，发病晚，无阳性家族史[8-9]。临床上常用的治疗手段包括化学治疗、外放射治疗、冷冻治疗、温热治疗、光凝固治疗、光动力学治疗和眼球摘除手术。

miRNA-200家族在肿瘤的生长、增殖、侵袭和转移中发挥着极其重要的作用[10-11]。许多研究显示miRNA-200b在细胞，组织和不同的肿瘤中均表达异常[12-16]。但迄今为止，很少有关于miRNA-200b在视网膜母细胞瘤中表达情况及相关功能的研究。

在本研究中，首先我们通过荧光素酶活性检测证实VEGF为miRNA-200b的靶基因。为进一步验证miRNA-200b对视网膜母细胞瘤细胞的生长增殖的影响，我们分别转染sh-VEGF及对照组(shRNA-NC)到Y79细胞中，通过蛋白定量和蛋白免疫印迹法证实sh-VEGF对VEGF表达的抑制作用后，MTS法检测细胞生长增殖活性验证过表达miRNA-200b和下调VEGF的表达具有协同作用，即均能抑制视网膜母细胞瘤细胞生长增殖。在分别转染VEGF及对照组(vector)到Y79细胞中，通过蛋白定量和蛋白免疫印迹法证实转染VEGF可增加VEGF的蛋白表达后，MTS法检测细胞生长增殖活性验证过表达VEGF能够逆转miRNA-200b对视网膜母细胞瘤细胞生长增殖抑制作用。最后我们通过分别转染VEGF、vector以及miRNA-200b与miRNA-NC、VEGF与vector、miRNA-200b+VEGF与miRNA-NC+vector到Y79细胞中，统计基底膜细胞数，发现miRNA-200b能通过靶向VEGF抑制Y79细胞的侵袭能力。

综上所述，miRNA-200b可通过直接靶向VEGF抑制视网膜母细胞瘤的生长与侵袭，miRNA-200b可能为视网膜母细胞瘤的潜在的治疗靶点，为今后该疾病的防治提供了新的切入点。

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(本文编辑：杨江瑜)

miRNA-200b inhibits retinoblastoma cell proliferation and invasion by targeting VEGF

Liu Yuefeng, Luo Weimin, Zhang Yong, Zhong Xiaodong.

Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China Corresponding author, Luo Weimin, E-mail: luoweimin0803@sina.com

ObjectiveTo explore whether miRNA-200b inhibits retinoblastoma cell proliferation and invasion by targeted-regulating the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), and further elucidate the molecular mechanism underlying the anti-tumor function of miRNA-200b. MethodsRetinoblastoma cell line Y79 was divided into miRNA-200b, miRNA-NC, sh-VEGF, shRNA-NC, miRNA-200b+sh-VEGF and miRNA-NC+shRNA-NC groups. The effect of miRNA-200b upon the luciferase activity of VEGF 3’-UTR was evaluated by luciferase assay. The intervention effect of sh-VEGF transfection was assessed by Western blot. The proliferation and invasion ability of Y79 cells in each group were evaluated by MTS and Transwell assays when transfected with miRNA-200b and miRNA-NC, sh-VEGF and shRNA-NC, miRNA-200b+sh-VEGF and miRNA-NC+shRNA-NC, respectively. ResultsLuciferase assay revealed that miRNA-200b could specifically bind with the 3’-UTR of VEGF and suppress the luciferase activity. Western blot detected that the expression of VEGF protein in the sh-VEGF transfection group was significantly down-regulated compared with that in the shRNA-NC group (P<0.05). MTS assay revealed that the survival rates of Y79 cells at 48 h after miRNA-200b and sh-VEGF transfection were considerably lower compared with those in corresponding control groups (both P<0.05). At 48 h following co-transfection with miRNA-200b and sh-VEGF, the survival rate of Y79 cells was significantly lower than those in corresponding control, miRNA-200b and sh-VEGF groups (all P<0.05). Transwell assay showed that the invasion ability of Y79 cells through the basement membrane was significantly lower compared with those at 48 h after miRNA-200b and sh-VEGF transfection (both P<0.05). At 48 h after co-transfection with miRNA-200b and sh-VEGF, the invasion ability of Y79 cells through the basement membrane was considerably lower than those in the corresponding control, miRNA-200b and sh-VEGF groups (all P<0.05). ConclusionmiRNA-200b inhibits the proliferation and invasion of retinoblastoma cells by targeted regulation of VEGF expression.

Retinoblastoma; MiRNA-200b; Vascular endothelial growth factor; Proliferation;Invasion

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.08.005

十堰市科技课题(14Y40)；湖北省教育厅科学研究计划指导性项目(B2015477)

442000 十堰，湖北医药学院附属十堰市太和医院眼科中心

，罗卫民，E-mail: luoweimin0803@sina.com

2016-01-06)