杜仲叶水提液除杂工艺的优化

2016-09-06王柏强何效平曾芝兰江承平川北医学院附属医院药剂科四川南充637000川北医学院药学院四川南充637000

中成药 2016年6期

王柏强，刘福*，何效平，曾芝兰，江承平（.川北医学院附属医院药剂科，四川南充637000；2.川北医学院药学院，四川南充637000）

杜仲叶水提液除杂工艺的优化

王柏强1，2，刘福1，2*，何效平1，曾芝兰1，江承平1，2
（1.川北医学院附属医院药剂科，四川南充637000；2.川北医学院药学院，四川南充637000）

目的优选杜仲叶水提液的除杂工艺。方法采用高速离心法、醇沉法、壳聚糖絮凝沉淀法、ZTC絮凝沉淀法、壳聚糖絮凝澄清-高速离心法、ZTC絮凝澄清-高速离心法对杜仲叶水提液进行澄清处理，筛选出适宜的澄清方法。以绿原酸保留率、鞣质和蛋白质去除率以及药液澄明度为评价指标，在单因素试验基础上，应用正交试验设计优化澄清工艺。结果最佳澄清方法是壳聚糖絮凝澄清-高速离心法，该方法处理后提取液有效成分保留率为89.5%，蛋白质和鞣质去除率为分别为54.4%和57.5%，澄明度和稳定性良好。结论壳聚糖絮凝澄清-高速离心法可作为杜仲叶水提取液的最佳澄清工艺，其稳定可行，而且有效成分损失少。

杜仲；叶；水提液；除杂；单因素试验；正交试验

杜仲平压片收载于原卫生部颁药品标准《中药成方制剂》（第11册），为杜仲Eucommia folium叶经提取纯化后加工制成的片剂［1］，用于治疗高血压、头晕目眩、腰膝酸痛、筋骨痿软等症。原生产工艺中采用水提醇沉法除杂［2］，虽能去除部分蛋白质，但对鞣质效果较差，而且需要耗费大量乙醇，成本较高，周期长。为了降低生产成本，提高产品质量，本实验以杜仲叶水提液为研究对象，以绿原酸保留率、鞣质和蛋白质去除率以及药液澄明度为评价指标，在单因素试验基础上，应用正交试验设计优选最佳除杂工艺。

1　仪器与试药

1.1仪器 10A高效液相色谱仪、SPD-10A紫外检测器（日本岛津公司）；Hypersic C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；TG16-WS高速离心机（湘仪离心机有限公司）；HI303磁力搅拌器（汇尔仪器设备有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2试药杜仲叶由重庆医药公司提供，经川北医学院药学院李生茂讲师鉴定为杜仲科植物杜仲Eucommia uimoides O1iv.的干燥叶。绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号0753-200413）；壳聚糖（上海华凯科技贸易公司）；ZTC1+1（天津振天成科技有限公司）。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1澄清工艺考察以绿原酸保留率、鞣质和蛋白质去除率以及药液澄明度为评价指标，采用高速离心法、醇沉法、壳聚糖絮凝沉淀法、ZTC絮凝沉淀法、壳聚糖絮凝澄清-高速离心、ZTC絮凝澄清-高速离心法对杜仲叶水提液进行澄清工艺研究。首先对各方法进行单因素考察，然后在各法最优条件下进行澄清处理，以筛选出最佳除杂方法。

2.1.1提取液制备按处方称取6个处方量杜仲叶，加水煎煮3次，第1次加10倍量水煎煮1 h，剩下2次加8倍量水煎煮45 min，滤过，合并滤液，减压浓缩，均分成6份，备用。

2.1.2高速离心法取 “2.1.1”项下提取液一份，置于10 000 r/min离心机中离心20 min，取上层清液，加水定容。

2.1.3醇沉法取 “2.1.1”项下提取液一份，加5倍量乙醇搅拌，静置过夜，滤过，滤液浓缩至无醇味，加水定容。

2.1.4壳聚糖絮凝沉淀法［3-5］称取壳聚糖粉末1 g，加入1%醋酸溶液100 mL，搅拌后静置24 h，即得1%壳聚糖溶液。取 “2.1.1”项下提取液一份，调节pH值至5，加热恒温至60℃，按0.3 g/L用量加入1%壳聚糖溶液，于100 r/min转速下搅拌5min，静置，滤过，定容。

2.1.5ZTC絮凝沉淀法配制澄清剂溶液［6］。方法为称取ZTC澄清剂A组份1.0 g，加少量纯化水搅成糊状，再加纯化水至100 mL，溶胀24 h，搅拌后脱脂棉过滤，即得1%黏胶液。按相同方法，将B组份用1%醋酸溶液配制成1%黏胶液。

取 “2.1.1”项下提取液一份，加热恒温至60℃，按1.0 g/L用量加入B组份，搅匀，再按0.5 g/L用量加入A组份，在100 r/min转速下搅拌5 min，静置，滤过，定容。

2.1.6 壳聚糖絮凝澄清-高速离心法取“2.1.1”项下提取液一份，调节pH值至5，加热恒温至60℃，按0.3 g/L用量加入1%壳聚糖溶液，于100 r/min转速下搅拌5 min，静置，然后于10 000 r/min离心机中离心20 min，取上清液，加水定容。

2.1.7ZTC絮凝澄清-高速离心法取“2.1.1”项下提取液一份，加热恒温至60℃，按1.0 g/L用量加入ZTC1+1絮凝剂B组份，搅匀，再按0.5 g/L用量加入ZTC1+1絮凝剂A组份，在100 r/min转速下搅拌5 min，静置，然后于10 000 r/min离心机中离心20 min，取上清液，加水定容。

2.2绿原酸含有量的测定［7］

2.2.1色谱条件 Hypersic C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液（13∶87）；体积流量1.0 mL/min；检测波长327 nm；柱温25℃。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的绿原酸对照品10 mg，50%甲醇溶解并定容至50 mL棕色量瓶中，即得0.2mg/mL对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备精密量取原药液和6种方法制得的样品各0.5 m L，置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4线性关系考察精密量取绿原酸对照品溶液0.1、1、5、8、10 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，在 “2.2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（y），溶液质量浓度为横坐标（c）进行线性回归，得回归方程y= 31 820c+10 791（r=0.999 9），表明绿原酸在 2. 0～200μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5样品含有量测定精密吸取对照品与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算绿原酸的含有量。绿原酸保留率=（除杂后药液中绿原酸含有量/提取液中绿原酸含有量）×100%。

2.3鞣质含有量的测定［8-10］采用以磷钼钨酸为显色剂，干酪素为鞣质吸附剂，没食子酸为对照品的磷钼钨酸比色法。在碱性条件下加入磷钼钨酸，采用紫外分光光度法于760 nm波长处分别测定样品溶液中总多酚和不被吸附多酚的含有量，计算样品中鞣质的含有量。鞣质去除率=［（1-除杂后药液中鞣质含有量 /提取液中鞣质含有量）］×100%。

2.4蛋白质含有量的测定［11-12］采用灵敏度高的Bradford法，以考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合后，于595 nm波长处测定样品的吸光度值，计算样品中蛋白质的含有量。蛋白质去除率=（1-除杂后药液中蛋白质含有量/提取液中蛋白质含有量）×100%。

2.5筛选结果采用综合评分法［13-14］，选择绿原酸保留率、鞣质和蛋白质去除率以及药液澄明度作为评价指标，权重系数分别为0.5、0.2、0.2、0.1。澄清度评分标准为混浊1分，较澄清2分，澄清3分，综合评分=绿原酸保留率×50+鞣质去除率×20+蛋白质去除率×20+（澄清度得分/最澄清得分） ×10。结果见表1。由表可知，澄清效果依次为壳聚糖絮凝澄清-高速离心法＞ZTC絮凝澄清-高速离心法＞壳聚糖絮凝沉淀法＞ZTC絮凝沉淀法＞醇沉法＞高速离心法。因此，本实验选择壳聚糖絮凝澄清-高速离心法作为杜仲叶水提液的澄清除杂工艺。

表1　澄清方法的筛选结果（±s）

澄明度得分　　综合评分高速离心法方法　　绿原酸保留率/%　　鞣质去除率/%　　蛋白质去除率/% 87.4±0.26　45.2±0.44　48.6±0.42　3　72.5 92.7±0.47　15.3±0.29　14.8±0.17　2　59.0醇沉法　82.6±0.40　24.9±0.45　43.1±0.51　2　61.6壳聚糖絮凝沉淀法　90.4±0.48　43.9±0.32　48.4±0.37　2　70.3 ZTC絮凝沉淀法　88.5±0.39　42.5±0.29　44.7±0.54　2　68.4壳聚糖絮凝澄清-高速离心法　89.2±0.36　47.9±0.31　51.4±0.46　3　74.5 ZTC絮凝澄清-高速离心法

2.6壳聚糖絮凝澄清-高速离心工艺的优化在单因素考察的基础上，选择壳聚糖用量、药液比、药液温度、搅拌时间、搅拌速度、药液pH值及离心转速7个因素，以绿原酸保留率、鞣质和蛋白质去除率以及药液澄明度为评价指标，采用L18（37）正交表设计方案。因素水平和结果见表2～3，方差分析见表4。

表3显示，各因素影响程度依次为A＞B＞F＞E＞G＞C＞D。由表4可知，因素 A、B、E、F具有显著性差异（P＜0.05），而C、D、G差异无统计学意义（P＞0.05）。最终确定，最佳工艺条件为A3B2C2D3E2F2G3，即壳聚糖用量0.4 g/L，药液比1∶2，药液温度60℃，搅拌时间6 min，搅拌速度100 r/m in，药液 pH 5.0，离心转速10 000 r/min。

2.7验证实验按最佳澄清工艺条件进行6次验证实验，结果见表5。由表可知，测得值与优化实验结果相近，说明壳聚糖絮凝澄清-高速离心法合理可行，稳定可靠。

表2　因素水平

表3　正交试验结果

表4　方差分析

表5　验证实验结果（n=6）

3　讨论

中药成分复杂，提取液中往往含有大量树脂状胶体物、鞣质、纤维素、淀粉、蛋白质等无活性的杂质成分。药材制成胶囊、片剂、颗粒剂等制剂时，因提取浸膏固形物多，剂量大，故服用不便。杜仲平压片以绿原酸含有量为其质量评价标准，因此在对杜仲叶水提取液进一步纯化时，选择绿原酸保留率、鞣质去除率、蛋白质去除率、澄明度等作为评价指标，并进行综合评分，可用于评价澄清除杂工艺的优劣。

在筛选纯化方法时发现，醇沉法除杂后，浸膏得率较低，但有效成分损失较大，药液中杂质沉淀速度慢，费时，澄清液乳光严重，鞣质去除率低；高速离心法有效成分保留率相对较高，浸膏得率最大，但除杂效果不理想，澄清液长时间放置易产生沉淀；壳聚糖絮凝澄清-高速离心法与ZTC絮凝澄清-高速离心法处理后的样品在浸膏得率上无显著性差异，但前者较大程度上保留了药液中的有效成分，对鞣质及蛋白质的去除效果明显，药液澄明度好，澄清剂用量小，达到了精制中药提取液的要求，而且成本低，操作简便。因此，本实验选择该方法进行杜仲叶水提液的除杂工艺研究。

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