云南栽培灯盏花指纹图谱建立及4个成分测定

张高菊， 杨生超， 沈 勇， 孟珍贵， 张广辉（.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明6500；.云南农业大学，云南省优势中药材规范化种植工程研究中心，云南昆明6500）



云南栽培灯盏花指纹图谱建立及4个成分测定

张高菊1， 杨生超2*， 沈 勇1， 孟珍贵1， 张广辉2
（1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明650201；2.云南农业大学，云南省优势中药材规范化种植工程研究中心，云南昆明650201）

目的 采用HPLC法建立云南（大理、红河、曲靖）栽培灯盏花Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.的指

纹图谱，并测定绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、飞蓬酯乙、灯盏乙素的含有量。方法 分析采用Agi1ent ZORBAX SBC18色谱柱 （250mm×4.6mm，5μm）；流动相为0.3%磷酸 （A）-甲醇 （B），梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；检

测波长335 nm；柱温20℃。结果 HPLC指纹图谱中有17个共有峰，相似度大于0.971。红河栽培灯盏花中灯盏乙

素和4个成分的总含有量明显高于大理，但3，5-二咖啡酰奎宁酸显著低于大理，两地绿原酸和飞蓬酯乙相近。结论红河栽培灯盏花质量更稳定，更有利于质量控制。

灯盏花；云南；绿原酸；3，5-二咖啡酰奎宁酸；飞蓬酯乙；灯盏乙素；指纹图谱；HPLC

灯盏花又名灯盏细辛，为菊科飞蓬属植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus（vant.）Hand.Mazz.的干燥全草，为传统苗药，具有活血通络止痛，祛风散寒功效［1］。现代药理研究证明，灯盏花的主要活性成分为黄酮 （苷）及酚类成分，包括灯盏乙素（野黄芩苷）、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、飞蓬酯乙等［2］，对中风偏瘫、老年痴呆、脑缺血等心脑血管疾病有较好的疗效［3-5］。

灯盏花广泛分布于我国西南各省，但由于市场需求量大，野生资源已无法满足市场［6］。云南作为栽培灯盏花的主产区，由于不同栽培条件、采收季节等原因导致其质量参差不齐，因此有必要采取相应手段对该药材质量进行控制。前人对栽培灯盏花进行过大量的指纹图谱研究［7-10］，或只对其主要成分进行定性定量分析［11-12］，本实验拟建立栽培灯盏花HPLC指纹图谱，确定指纹峰，同时测定绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、飞蓬酯乙、灯盏乙素4个化合物含有量，为其质量控制提供理论依据。

1　材料

灯盏花地上部分于2014年10月采自云南大理、曲靖和红河3个州 （市），共22批 （S1～S20），经云南农业大学杨生超教授鉴定为灯盏花E.breviscapus。

2　仪器与试药

Agi1ent 1260系列高效液相色谱仪，包括G1311C四元泵、G1329B自动进样仪、G1315D光电二极管阵列检测器和Agi1ent Chem Station工作站（美国Agi1ent公司）；NewC1assic MS半微量型电子天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）。

绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、飞蓬酯乙和灯盏乙素对照品 （北京世纪奥科生物技术有限公司，含有量均大于98%）。甲醇为色谱纯；磷酸为分析纯；水为超纯水 （18.2ΩPa）。

3　方法与结果

3.1溶液的制备

3.1.1对照品溶液 精密称取灯盏乙素、绿原酸、飞蓬酯乙和3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，甲醇定容到10 mL量瓶中，摇匀，制得分别含4种成分410.0、300.0、432.0和223.0μg/m L的混合对照品溶液，4℃下保存，备用。

3.1.2供试品溶液 精密称取灯盏花样品粉末0.5 g，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，浸泡过夜，超声提取30min，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得［13］。

3.2方法学建立

3.2.1色谱条件 Agi1ent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为0.3%磷酸水 （A）-甲醇 （B），梯度洗脱 （0～20 min，10%→20%B；20～34 min，20%→31%B；34～45 min，31%→80%B）；体积流量1.0 mL/min；检测波长335 nm；柱温20℃；进样量5μL。

3.2.2线性关系考察 精密吸取 “3.1.1”项下对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μL，依次注入HPLC色谱仪，在“3.2.1”项色谱条件下分析，以色谱峰峰面积为纵坐标 （y），进样量为横坐标 （x）绘制回归方程 （表1），对照品图谱见图1。

表1　4种成分回归方程Tab.1 Regression equations of four constituents

图1　对照品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance

3.2.3精密度试验 精密吸取对照品溶液5μL，在 “3.2.1”项色谱条件下重复进样6次，测得灯盏乙素、绿原酸、飞蓬酯乙和3，5-二咖啡酰奎宁酸峰面积和保留时间RSD均小于1.0%，表明仪器精密度良好。

3.2.4 稳定性试验 取供试品溶液 （S20）适量，在 “3.2.1”项色谱条件下于0、2、4、6、12、24 h进样测定，测得灯盏乙素、绿原酸、飞蓬酯乙和3，5-二咖啡酰奎宁酸峰面积RSD均小于1.2%，保留时间RSD均小于0.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.2.5重复性试验 按 “3.1.2”项下方法平行制备供试品溶液 （S20）5份，每份进样5μL，在“3.2.1”项色谱条件下测定，测得灯盏乙素、绿原酸、飞蓬酯乙和3，5-二咖啡酰奎宁酸平均含有量分别为13.212、1.397、3.662、1.215 mg，峰面积RSD均小于1.1%，保留时间RSD均小于0.1%，表明该方法重复性良好。

3.2.6加样回收率试验 精密称取各成分含有量已知的灯盏花 （S20）0.25 g，平行5份，分别加入1.203、0.165、0.340和0.114 mg/mL灯盏乙素、绿原酸、飞蓬酯乙和3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品5 mL，70%甲醇定容至50 mL，按“3.1.2”项下方法制得供试品溶液，在 “3.2.1”项色谱条件下测定，结果见表2。

表2　加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

3.3指纹图谱相似性评价 以灯盏花 （S20）为参照谱，利用中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）软件对采集的22批样品进行相似度评价，得到指纹图谱。匹配结果显示，有17个共有峰 （图2～3），相似度见表3。

图2　样品典型HPLC色谱图Fig.2 Typical HPLC chromatogram of sam ple

图3　HPLC指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints

表3　22批样品相似度Tab.3 Sim ilarities of twenty-tw o batches of sam p les

3.4样品测定 外标法计算22批样品中绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、飞蓬酯乙和灯盏乙素的含有量。结果见表4，统计分析见表5。

表4　含有量测定结果Tab.4 Resultsofcontentdetermination

表5　统计分析结果 （±s）Tab.5 Resultsofstatisticalanalysis（±s）

表5　统计分析结果 （±s）Tab.5 Resultsofstatisticalanalysis（±s）

注：与大理比较，*P＜0.05。由于曲靖仅采集到2批样品，故未进行统计分析

采集地　　绿原酸/%　3，5-二咖啡酰奎宁酸/%　　飞蓬酯乙/%　　灯盏乙素/%　　总含有量/%大理　0.311±0.063　0.386±0.177*0.524±0.063　1.976±0.146　3.196±0.337红河　0.344±0.075　0.268±0.028　0.693±0.044　2.640±0.050*　3.945±0.143*

4　讨论与结论

本实验对22批云南栽培灯盏花样品进行指纹图谱分析，结果显示所有样品相似度都大于0.971，共有峰相对保留时间RSD在0.01%～0.25%之间，峰面积RSD在11.99%～72.46%之间，其含有量差异显著，但化学成分组成不显著。大理地区相似系数大于0.957，RSD为1%；红河地区相似系数大于0.996，RSD为0.002%，说明红河产灯盏花质量更稳定。对2个地区4种成分含有量进行统计分析，发现红河产灯盏花中灯盏乙素和4种成分总含有量显著高于大理，但3，5-二咖啡酰奎宁酸显著低于大理；2个地区灯盏乙素含有量均在1.67%以上，远高于药典标准的0.3%；绿原酸和飞蓬酯乙差异不显著，这可能与地理环境差异和栽培管理技术有关。

灯盏花具有活血通络止痛，祛风散寒功效，以其中灯盏花素为原料的制剂有灯盏花素注射液、灯盏花素片等，已广泛用于治疗心脑血管疾病。孙汉董等［2］研究发现，灯盏花中的酚性成分 （3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、飞蓬酯乙等）具有与灯盏乙素相当的抗血栓、扩张血管活性，这为灯盏花综合开发利用提供了依据。上述指纹图谱分析及含有量测定结果表明，云南产栽培灯盏花质量稳定，有效成分含有量高，尤以泸西产灯盏花质量更稳定均一，更有利于质量控制，可作为各种以灯盏花为原料药制剂的首选。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：11.

［2］孙汉董，赵勤实.防治心脑血管疾病药物-灯盏细辛酚的研究与开发［J］.化学进展，2009，21（1）：77-83.

［3］Sang Z，Qiang X，Li Y，et al.Design，synthesis and eva1uation of scute11arein-O-a1ky1amines asmu1tifunctiona1 agents for the treatment of A1zheimer's disease［J］.Eur J Med Chem，2015，94：348-366.

［4］Huang P P，Han ZC，Li S Z，et al.Sixty-four patients with ischemic diseases of 1ower 1imbs treated by combined therapy of Erigeron breviscapus injection andheparin［J］.Chin J Integr TraditWest Med，2004，24（11）：1016-1017.

［5］Chai L J，Guo H，Li H，etal.Scute11arin and caffeic acid ester fraction，active components of Dengzhanxixin injection，upregu-1ate neurotrophins synthesis and re1ease in hypoxia/reoxygenation rat astrocytes［J］.J Ethnopharmacol，2013，150（1）：100-107.

［6］俞宏渊，陈宗莲.灯盏细辛的家化栽培［J］.云南植物研究，2002，24（3）：115-120.

［7］董 媛，陈 彬，李海山，等.灯盏细辛药材HPLC指纹特征研究［J］.药物分析杂志，2010，30（7）：1228-1232.

［8］高 展，黄罗生.灯盏细辛HPLC指纹图谱的研究［J］.海峡药学，2005，17（3）：86-88.

［9］张 平.不同产地的灯盏花HPLC指纹图谱的比较研究［J］.中外健康文摘：临床医师，2008，5（7）：80-81.

［10］王黎明，梁建宁，黄晓燕，等.灯盏花素分散片及灯盏花素原料的HPLC指纹图谱研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（10）：77-80.

［11］郑 林，王永林，王爱民，等.UPLC-PDA法同时测定灯盏细辛中飞蓬苷、绿原酸和野黄芩苷的含量［J］.中成药，2010，32（9）：1619-1622.

［12］耿家玲，孟 芹.HPLC法测定灯盏细辛中绿原酸和咖啡酸的含量［J］.中国药师，2010，13（5）：701-702.

［13］李晓波，汪瑞波，沈 勇，等.HPLC测定灯盏花不同部位绿原酸、灯盏乙素、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸含量［J］.中国中药杂志，2013，38（14）：2237-2240.

Establishment of fingerprints of Erigeron breνiscapus cultivated in Yunnan and determ ination of four constituents

ZHANG Gao-ju1， YANG Sheng-chao2*， SHEN Yong1， MENG Zhen-gui1， ZHANG Guang-hui2
（1.College of Agriculture and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2.Yunnan Provincial Research Center of Good Agriculture Practice for Dominant Chinese Medicinal Materials，Yunnan Agriculture University，Kunming 650201，China）

AIM To estab1ish the fingerprints of Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.cu1tivated in Yunnan（Da1i，Honghe and Qujing）and to determine the contentsof ch1orogenic acid，3，5-dicaffey1quinic acid，erigoster B and scute11arin by HPLC.METHODS The ana1ysiswas carried out on an Agi1ent ZORBAX SB-C18co1-umn（250 mm×4.6mm，5μm），mobi1e phase was0.3%phosphoric acid（A）-acetonitri1e（B）with gradient e1ution，f1ow rate was 1.0 mL/min，detection wave1ength was set at 335 nm，and co1umn temperature was maintained at20℃.RESULTS There were seventeen common peaks in the HPLC fingerprints，whose simi1aritiesweremore than 0.971.The contents of scute11arin and tota1contentof four constituents in E.Breviscapus cu1tivated in Honghe were significant higher than those cu1tivated in Da1i，but 3，5-dicaffey1quinic acid content was 1ower，and the contents of ch1orogenic acid and erigoster B in these two districtswere simi1ar.CONCLUSION The qua1ity of E.Breviscapus cu1tivated in Honghe ismore stab1e，which ismore beneficia1 for qua1ity contro1.

Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.；Yunnan；ch1orogenic acid；3，5-dicaffey1quinicacid；erigoster B；scute11arin；fingerprints；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1315-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.023

2015-08-03

国家科技支撑计划项目 （2011BAI13B05）

张高菊（1988—），女，硕士生，研究方向为药用植物资源化学与开发利用。E-mai1：zhanggaoju2665@163.com

杨生超 （1972—），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为药用植物资源与规范化种植。Te1：（0871）5227059，E-mai1：shengchaoyang@163.com