HPLC-DAD法和一测多评法同时测定安息香中4种成分

胡 攀， 夏厚林， 文冰杰， 李瑞煜， 杨孟妮， 张 慧（成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，四川成都611137）



HPLC-DAD法和一测多评法同时测定安息香中4种成分

胡 攀， 夏厚林*， 文冰杰， 李瑞煜， 杨孟妮， 张 慧
（成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，四川成都611137）

目的 建立高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法和一测多评（QAMS）法同时测定安息香Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.中香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯以及苯甲酸苄酯的含有量。方法 HPLC-DAD法同时测定4种成分含有量，计算苯甲酸松柏酯与其他3种成分的相对校正因子，考察相对保留时间法和线性回归法对色谱峰定位的影响，并比较这两种方法的重复性。结果 15批样品中香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯、苯甲酸苄酯的含有量分别为0.692%～2.621%、2.944%～15.628%、12.649%～62.589%、0.514%～2.034%，线性回归法较相对保留时间法更准确，3个相对校正因子重复性良好，两种方法无显著差异。结论 一测多评法可用于测定安息香中的总香脂酸类成分。

安息香；香草醛；苯甲酸；苯甲酸松柏酯；苯甲酸苄酯；HPLC-DAD；一测多评

安息香Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.为芳香开窍药，具有开窍醒神、行气活血、止痛之功效，用于治疗中风痰厥、气郁暴厥、中恶昏迷、心腹疼痛、产后血晕、小儿惊风等症状［1］。现代药理研究表明，其有抗炎解热［2］、脑缺血缺氧保护、促进血脑屏障通透性［3-5］、抗肿瘤［6］等作用。

安息香为树脂类药材，其主要成分为总香脂酸，如香草醛、苯甲酸、苯甲酸苄酯、苯甲酸松柏酯等［7-8］。目前，各国药典对该药材的质量控制均以总香脂酸为主要指标，如 《欧洲药典》（第7版）、《印度药典》（2010版）均采用滴定法测定其含有量；《中国药典》2005版采用重量法测定其含有量，而2010版和2015版均测定水解后苯甲酸含有量。

香草醛又名香兰素，为安息香中主要的香味成分，亦为传统经验鉴别的重要气味辨别物；苯甲酸又名安息香酸，多国药典均以其为定性鉴别或含有量测定指标；苯甲酸松柏酯及苯甲酸苄酯均为安息香中重要的总香脂酸酯类成分，水解后均能产生苯甲酸及其他物质，而且含有量相对较高［9］。以上成分除苯甲酸外［10］，目前均未见测定的报道，而且苯甲酸松柏酯和苯甲酸苄酯暂无法定对照品，而采用一测多评法可以减少对照品的使用量，节约成本。因此，本实验先以高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法开展以上4种成分含有量测定方法的研究，再以主要活性成分苯甲酸松柏酯［11］为内参物，采用一测多评法来同步测定安息香中多个总香脂酸成分含有量，并将两种方法进行比较。

1　材料与仪器

1.1药材 安息香由荷花池专业市场、四川科伦药业 （批号141201）以及成都中医药大学标本室提供，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为安息香科植物白花树Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.的干燥树脂。

1.2对照药材及对照品 安息香对照药材、苯甲酸、香草醛对照品 （中国食品药品检定研究院，批 号 分 别 为121186-201302、100419-201302、110501-201102）；苯甲酸苄酯对照品 （德国 Dr. Ehrenstorfer公司，批号20102）；苯甲酸松柏酯（自制，经1H-NMR、13C-NMR谱鉴定，含有量大于99%）。

1.3仪器与试剂 Agi1ent 1200高效液相色谱仪，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Agi1ent Chem Station色谱数据工作站 （美国安捷伦公司）；SSI Series 1500高效液相色谱仪 （美国SSI公司）；SK-5200H超声波清洗器 （上海科导超声仪器有限公司）；XP205电子分析天平 （梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。甲醇、乙腈为色谱纯 （美国Fisher公司）；磷酸为优级纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2　方法与结果

2.1色谱条件 Waters XBridgeTM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B）；体积流量1.0 mL/min，梯度洗脱 （程序见表1）；柱温30℃；检测波长230 nm。结果见图1。

表1　梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program s

图1　HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s

2.2对照品溶液的制备 分别精密称取香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯、苯甲酸苄酯对照品适量，加甲醇制成含香草醛0.928 mg/mL、苯甲酸0.969 5 mg/mL、苯甲酸松柏酯3.277 mg/mL、苯甲酸苄酯0.415 5 mg/m L的对照品贮备液，置于冰箱中冷藏保存。再分别吸取适量，乙腈∶水 （50∶50）稀释，制成含香草醛46.40μg/mL、苯甲酸96.95μg/mL、苯甲酸松柏酯327.70μg/mL、苯甲酸苄酯41.55μg/m L的混合对照品溶液，备用。

2.3供试品溶液的制备 精密称取安息香粉末（过3号筛）0.1 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇20mL，超声提取30min，转移至50mL量瓶中，少量甲醇多次洗涤，洗液合并，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4方法学考察

2.4.1线性范围考察 精密量取混合对照品溶液20、15、10、8、5、2、1μL，在 “2.1”项色谱条件下进样分析，每个进样量进样3次，记录峰面积，并取平均值。以峰面积为纵坐标 （Y），样品进样量为横坐标 （X）进行线性回归，绘制标准曲线，结果见表2，表明在各自范围内线性关系良好。

表2　4种成分的标准曲线Tab.2 Standardcurvesoffourconstituents

2.4.2精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10μL，进样6次，测定峰面积。结果，香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯和苯甲酸苄酯RSD分别为0.94%、1.11%、1.06%、0.96%，表明仪器精密度良好。

2.4.3稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、6、12、24、48h进样分析。结果，香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯和苯甲酸苄酯RSD分别为1.81%、2.04%、1.91%、2.79%，表明样品在48h内稳定性良好。

2.4.4重复性试验 精密称取安息香0.1g，共6份，按 “2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果，香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯和苯甲酸苄酯含有量 RSD分别为1.56%、2.64%、1.75%、2.38%，表明该方法重复性良好。

2.4.5加样回收率 精密称取药材0.05g，共6份，分别精密加入香草醛1.5mL、苯甲酸苄酯1mL。再精密称取同一批安息香0.01g，共6份，分别精密加入苯甲酸1.5mL、苯甲酸松柏酯0.5mL，按 “2.3”项下方法制备供试品溶液 （溶剂加入量为原加入量的1/5）进行测定，结果见表3。

2.5 “一测多评”耐用性和专属性考察

2.5.1相对校正因子计算 参照文献 ［12］的方法，以公式fk/s=（Ws×Ak）/（Wk×As）计算相对校正因子，待测成分的量以公式W′k=（Ws× A′k）/（fk/s×As）计算。其中，fk/s为相对校正因子，Ws为内标物含有量，As为内标物峰面积，Wk为其他对照组分含有量，Ak为对照组分的峰面积，W′k为待测组分含有量，A′k为待测组分的峰面积。以苯甲酸松柏酯为内标，分别计算对香草醛、苯甲酸、苯甲酸苄酯的校正因子，结果见表4。

表3　加样回收率试验结果Tab.3 Resultsofrecoverytests

表4　相对校正因子Tab.4 Relativecorrectionfactors

2.5.2待测色谱峰的定位 以苯甲酸松柏酯为内参峰，分别测得香草醛、苯甲酸、苯甲酸苄酯的平均相对保留时间为0.269、0.369、1.202。

线性回归色谱峰定位法［13-14］以Agi1ent1200仪器使用的Waters柱为标准柱，选择苯甲酸和苯甲酸松柏酯的保留时间作为横坐标 （A），对应其他仪器及色谱柱苯甲酸和苯甲酸松柏酯的保留时间为纵坐标 （B）绘制回归方程，进行相应色谱峰定位。结果见表5。

表5　色谱峰定位结果Tab.5 Results of chromatographic peak positioning

2.6HPLC-DAD法与一测多评法比较 吸取对照品及供试品溶液各10μL（个别批次稀释后测定），注入HPLC色谱仪测定。HPLC-DAD法和一测多评法计算药材中香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯及苯甲酸苄酯含有量，结果见表6。

表6　测定结果比较 （%）Tab.6 Com parison of determ ination results（%）

测定结果用Pearson相关系数进行比较，测得香草醛的相对误差为-0.98%～0%，Pearson相关系数值为0.999 982；苯甲酸相对误差为0.90%～3.49%，Pearson相关系数值为0.999 920；苯甲酸苄酯相对误差为-0.70%～0%，Pearson相关系数值为 0.999 946；总量相对误差为 0.15% ～1.00%，Pearson相关系数值为0.999 982，表明两种方法无显著差异。

3　讨论

苯甲酸松柏酯为安息香中重要的活性成分［9］，据文献报道其含有量可达15%以上，经初步试验表明，其颜色在一定条件下由白色逐渐变深，与《中国药典》2015版记载安息香药材断面为白色，放置后逐渐变为淡黄色至红棕色［1］基本一致，因此，以苯甲酸松柏酯为指标来控制安息香药材质量具有重要意义。

本实验首次采用HPLC-DAD法同时测定了安息香中4个总香脂酸类成分的含有量，发现香草醛在0.714%～2.62%之间，苯甲酸在2.94%～15.63%之间，苯甲酸松柏酯在12.65%～62.59%之间，苯甲酸苄酯在0.474%～2.03%之间。随着存放年限的增加，15批样品中苯甲酸含有量逐渐升高，而苯甲酸松柏酯降低。因此，控制安息香质量采用多指标时更能反应该药材的真实情况。

在一测多评法研究中，本实验考察了相对校正因子法和斜率校正法［10-11］，发现前者计算结果与HPLC-DAD法基本一致，而后者误差较大，故采用相对校正因子法进行实验。

另外，还考察了Agi1ent1200和SSISeries1500两种HPLC系统，以及4根色谱柱，同时在不同实验室进行了复核实验。结果，苯甲酸松柏酯对香草醛、苯甲酸和苯甲酸苄酯的平均相对校正因子分别为1.09、1.10和1.05，RSD分别为3.41%、3.63%和2.32%，表明以苯甲酸松柏酯为内参物所测定的相对校正因子较为稳定，一测多评法具有可行性。

经Pearson检验，一测多评法与HPLC-DAD法测定结果无显著差异，表明一测多评法可用于安息香中总香脂酸的质量控制。另外，该方法可降低检测成本和时间，而且苯甲酸松柏酯作为内参物具有专属性，能够实现一个对照品在同一波长下对多个成分进行同时测定，能够满足基层药检的需求。在实际应用中，可视具体情况选择HPLC-DAD法或一测多评法。

同时，本实验研究了保留时间差法、相对保留时间法以及线性回归色谱峰定位法来对待测色谱峰进行定位。结果表明，保留时间差法在不同色谱柱重复性较差；相对保留时间法能够进行色谱峰定位；线性回归色谱峰定位法最为准确，但需使用2种对照品，与一测多评的初衷不符，而且相对保留时间法结合色谱图及紫外吸收特征，也能准确进行色谱峰定位。因此，可优先采用相对保留时间法，若该方法不能准确定位色谱峰，则可进一步考虑线性回归色谱峰定位法。

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Simultaneous determ ination of four constituents in Styrax tonkinensis by HPLCDAD and QAMS

HU Pan， XIA Hou-1in*， WEN Bing-jie， LIRui-yu， YANGMeng-ni， ZHANG Hui
（Schoolof Pharmacy，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine；Key Laboratory for Standardization ofChineseMateria Medica，Ministry of Education，Chengdu 611137，China）

AIM To estab1ish high performance 1iquid chromatography with diode array detection（HPLCDAD）and quantitative ana1ysisofmu1ti-components by sing1emarker（QAMS）methods for the simu1taneous determination of contents of vani11in，benzoic acid，conifery1benzoate and benzy1benzoate in Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart..METHODS HPLC-DAD was app1ied to simu1taneous1y determining the contents of these four constituents.The re1ative correction factors of conifery1benzoate to another three constituentswere ca1cu1ated.The effects of re1ative retention time and 1inear regression methods on positioning chromatographic peakswere investigated.And the reproducibi1itieswere then compared.RESULTS In fifteen batches of samp1es，the contents of vani11in，benzoic acid，conifery1 benzoate and benzy1 benzoate were 0.692%-2.621%，2.944%-15.628%，12.649%-62.589%and 0.514%-2.034%，respective1y.Linear regression method showed its superioty in accuracy as compared with re1ative retention time method.The reproducibi1ities of three re1ative correction factors were good.And these twomethods demonstrated no significant difference.CONCLUSION QAMS can be used for determining tota1ba1samic acids in S.tonkinensis.

Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.；vani11in；benzoic acid；conifery1 benzoate；benzy1 benzoate；HPLC-DAD；QAMS

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1274-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.015

2015-10-28

国家重点基础研究发展计划 （973计划）项目 （2007CB512606）

胡 攀（1989—），男，硕士，从事中药质量标准及物质基础研究。Te1：18224427340，E-mai1：hupanmai1@foxmai1.com

夏厚林 （1964—），男，教授，从事中药质量标准及物质基础研究。Te1：13568899011，E-mai1：xh164@163.com