UHPLC-MS/MS法同时测定蒲地蓝消炎片中10种成分

米建萍， 庞 倩， 徐远金*（1.北海市疾病预防控制中心，广西北海536000；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004；3.广西大学化学化工学院，广西南宁530004）



［质 量］

UHPLC-MS/MS法同时测定蒲地蓝消炎片中10种成分

米建萍1，2， 庞 倩2，3， 徐远金2，3*
（1.北海市疾病预防控制中心，广西北海536000；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004；3.广西大学化学化工学院，广西南宁530004）

目的 建立超高效液相色谱-串联质谱 （UHPLC-MS/MS）法同时测定蒲地蓝消炎片 （蒲公英、黄芩、苦地丁和板蓝根）中腺苷、表告依春、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、紫堇灵、乙酰紫堇灵、芹菜素、黄芩素和汉黄芩素的含有量。方法 分析采用Ec1ipse P1us C18RRHD色谱柱（1.8μm，2.1mm×50mm）；流动相为乙腈-0.2%乙酸水溶液，梯度洗脱；体积流量为0.3 mL/min。结果 10种成分分别在0.000 050 0～1.00、0.010 0～5.00、0.015 0～10.0、0.030 0～20.0、0.100～100、0.000 300～10.0、0.003 00～10.0、0.000 600～20.0、0.200～20.0、0.000 500～5.00mg/L范围内线性关系良好，平均加样回收率在91.4%～105.0%之间，RSD均小于2.0%。结论 该方法快速、简便、灵敏，适用于蒲地蓝消炎片的质量控制。

蒲地蓝消炎片；化学成分；UHPLC-MS/MS

蒲地蓝消炎片由蒲公英、黄芩、苦地丁和板蓝根4种中药组成，主要功效为清热解毒，抗炎消肿，用于治疗疖肿、咽炎、扁桃腺炎，腮腺炎等。方中蒲公英性寒，味苦、甘，有清热解毒、消肿散结、利尿通淋等功效；黄芩有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，用于治疗湿温、暑湿、胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高热烦渴、血热吐衄、痈肿疮毒、胎动不安；板蓝根具有清热解毒、凉血消肿、利咽之功效，用于治疗温疫时毒、发热咽痛、温毒发斑、痄腮、丹毒、臃肿疮毒等；苦地丁清热解毒、消痈肿，主治流行性感冒、上呼吸道感染、扁桃体炎、传染性肝炎、肠炎、肾炎、瘰疬、腮腺炎、结膜炎、急性阑尾炎及疔疮痈肿等［1］。

已有文献报道，黄芩中的黄酮［2-3］、蒲公英中的酚酸和黄酮［4-5］、苦地丁中的生物碱［6］、板蓝根中的腺苷和表告依春［7-8］等为主要活性物质。现行药典标准常用HPLC法进行中药质量控制指标的单一含有量分析，没有多种有效成分同时测定的方法。蒲地蓝制剂相关文献大多集中在临床使用及疗效观察方面，鲜有成分测定的报道，胡冰［9］采用测定了腺苷的含有量，邵礼梅等［10］对黄芩苷和黄芩素进行了测定，汤道权等［11］测定了黄芩苷的含有量，刘德胜等［12］对不同制剂中咖啡酸和绿原酸的含有量进行了测定，覃华亮［13］建立了测定紫堇灵含有量的方法，但同时测定多种成分的文献［14-15］较少，也尚无液相色谱-质谱联用分析方法的报道。本实验采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）法同时测定蒲地蓝消炎片中腺苷、表告依春、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、紫堇灵、乙酰紫堇灵、芹菜素、黄芩素和汉黄岑素，其简便快速，已用于实际样品的分析。

1　实验部分

1.1仪器与试剂 Agi1ent 1290 Infinity LC System、

Agi1ent6460 Trip1e Quad LC/MS仪（美国Agi1ent公司）；Synthesis A10TM超纯水系统（美国Mi11ipore公司）；ME2355、CPA2245电子天平（德国Sartorius公司）；KQ2200DV数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司，100W，40 kHz）。

腺苷 （批号110879-200202）、咖啡酸 （批号110885-200102）、阿魏酸 （批号 110773-200611）对照品 （中国食品药品检定研究院，含有量≥98%）；芹菜素对照品 （批号101207，四川省维克奇生物科技有限公司，含有量≥98%）；表告依春（批号130816）、绿原酸 （批号121125）、紫堇灵（批号130604）、乙酰紫堇灵 （批号130604）、黄芩素 （批号130119）、汉黄芩素 （批号131121）对照品 （成都菲普德生物科技有限公司，含有量≥98%）。甲醇、乙腈为色谱纯 （美国Fisher公司）；甲酸为分析纯 （广东光华科技股份有限公司）；乙酸为分析纯 （上海申博化工有限公司）；实验用水为超纯水。

1.2溶液配制

1.2.1对照品贮备液 精密称取腺苷、表告依春、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、紫堇灵、乙酰紫堇灵、芹菜素、黄芩素和汉黄芩素对照品各10.0 mg，甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，配成1.00 mg/mL贮备液，4℃下保存。使用前，50%甲醇溶液稀释至所需质量浓度。

1.2.2样品溶液 取蒲地蓝消炎片适量，除去糖衣，取内容物研磨粉碎，混匀。精密称取0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL 50%甲醇溶液摇匀，超声60 min，静置，冷却后取适量上清液，12 000 r/min离心10 min，稀释10倍，0.22μm微孔滤膜过滤，进样测定。

1.3色谱条件 Ec1ipse P1us C18RRHD色谱柱（1.8μm，2.1 mm×50 mm）；流动相乙腈（A）-0.2%乙酸水溶液 （B），梯度洗脱 （0～1 min，95%B；1～5 min，95%～80%B；5～9 min，80% B；9～10 min，80% ～75%B；10～15 min，75%～60%B；15～17 min，60%～0%B）；体积流量0.3 mL/min；进样量1μL。

1.4质谱条件 离子源为电喷雾电离源 （ESI），正、负离子快速切换多重反应监测模式 （MRM）监测；干燥气体 N2，温度300℃，体积流量10 L/min；雾化气体N2，雾化器压力2.8×105Pa；鞘气气体N2，温度360℃，体积流量12 L/min；毛细管电压4 000 V。

2　结果

2.1色谱与质谱行为 在选定的条件下，根据峰保留时间及质谱信息进行定性与定量分析。结果见图1。

2.2线性关系及检出限 取各对照品贮备液，精密配制不同质量浓度的混合标准溶液，于优化条件下进样测定，重复3次，以峰面积 （Y）对质量浓度 （X）进行回归，得到回归方程、相关系数和线性范围，信噪比 （S/N）等于3时对应成分的质量浓度作为其检出限，具体见表1，表明各成分在相应范围内线性关系良好。

2.3精密度试验 取同一批次样品6份，制备样品提取液，在优化条件下测得各成分的平均含有量分别为 0.560 6、0.031 7、0.677 7、0.601 2、0.148 0、0.239 4、0.031 8、0.008 2、9.844 8、1.591 2 mg/g，RSD为0.33%～2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4稳定性试验 取同一批次样品，制备样品提取液，在0、2、4、6、8、10 h于优化条件下测得RSD为0.7%～2.3%，表明样品溶液在10 h内稳定。

表1　回归方程、线性范围、相关系数及检出限Tab.1 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients and detection lim its

图1　MRM色谱图Fig.1 M ultip le reaction monitoring（M RM）chrom atogram s

2.5回收率试验 精密称取各成分含有量已知的的同批次样品0.5 g，共9份，每组3份，按高、中、低3个梯度分别加入不同量的对照品，按“1.2.2”项下方法制备样品溶液并进行测定，结果见表2。

表2　加样回收率试验结果（n=3）Tab.2 Results of recovery tests（n=3）

2.6含有量测定 精密称取4批样品，每批3份，按照优化的提取方法和条件计算各成分的含有量，结果见表3。

表3　含有量测定结果（mg/g）Tab.3 Results of content determ ination（mg/g）

3　讨论

3.1色谱条件的优化 实验发现，在流动相中添加低质量浓度的有机酸有利于各成分的分离，并且峰形对称；在流动相中添加甲酸时，能大幅度提高咖啡酸和绿原酸的检测灵敏度，但降低了其他成分的灵敏度；添加乙酸时，两者灵敏度随乙酸用量增加而提高。

另外，还对常用流动相甲醇-0.2%乙酸水溶液和乙腈-0.2%乙酸水溶液体系进行了考察，发现使用甲醇体系时，绿原酸、咖啡酸的灵敏度明显提高，但其他成分的灵敏度有所降低。综合考虑各成分的分离效果、检测灵敏度、色谱峰峰形等因素，选择乙腈-0.2%乙酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱。

3.2质谱条件的优化 根据不同物质，先选择正负离子反应模式，得到二级质谱特征离子图，见图2。再采用多重反应监测模式 （MRM），分别对各对照品的母离子进行二次碎裂，对选定的子离子优化源内碎裂电压、碰撞能量和加速电压，优化结果见表4。

图2　二级质谱图Fig.2 MS/MS spectra

表4　质谱参数Tab.4 M S parameters

3.3样品提取方法 取蒲地蓝消炎片适量，除去糖衣，研碎，混匀，称取0.5 g，置于不同具塞锥形瓶中，分别加入50 mL乙醇、50%乙醇、乙腈、50%乙腈、甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、水，密闭摇匀，超声60 min。静置，取上清液，12 000 r/min离心10 min，稀释10倍，0.22μm微孔滤膜过滤，进样测定。同时，还考察了15、30、45、60、90、120 min提取时间对提取效果的影响。最终，本实验选择50%甲醇，超声60 min提取样品。

4　结论

UHPLC-MS/MS结合了UHPLC分离度高、分析速度快，以及MS定性能力强、灵敏度高的优点，对中药及其制剂等复杂体系和样品的分析具有明显优势，为中药成分分析、质量控制及药代动力学研究提供了高效可靠的方法，已得到广泛应用。

本实验建立了UHPLC-MS/MS法同时测定蒲地蓝消炎片中腺苷、表告依春、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、紫堇灵、乙酰紫堇灵、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素10种有效成分含有量的分析方法，其简便、快速、灵敏度高，可用于该药物的质量控制。

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Simultaneous determ ination of ten constituents in Pudilan Xiaoyan Tablets by UHPLC-MS/MS

MIJian-ping1，2， PANG Qian2，3， XU Yuan-jin2，3*
（1.BeihaiMunicipal Center for DiseaseControland Prevention，Beihai536000，China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning 530004，China；3.School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China）

AIM To estab1ish an u1tra performance 1iquid chromatography with tandem mass spectrometry（UHPLC-MS/MS）method for the simu1taneous determination of adenosine，epigoitrin，caffeic acid，ch1orogenic acid，feru1ic acid，coryno1ine，acety1coryno1ine，apiginin，baica1ein and wogonin in Pudi1an Xiaoyan Tab1ets（TaraxaciHerba，Scutellariae Radix，Corydalis Bungeanae Herba and IsatidisRadix）.METHODS The ana1ysiswas performed on an Ec1ipse P1us C18RRHD co1umn（1.8μm，2.1mm×50mm），with amobi1e phase comprising of acetonitri1e-0.2%acetic acid aqueous so1ution in a gradient e1ution manner，at a f1ow rate of 0.3 mL/min.RESULTS Ten constituents showed good 1inear re1ationships within the ranges of 0.000 050 0-1.00 mg/L，0.010 0-5.00 mg/L，0.015 0-10.0 mg/L，0.030 0-20.0 mg/L，0.100-100 mg/L，0.000 300-10.0 mg/L，0.003 00-10.0 mg/L，0.000 600-20.0 mg/L，0.200-20.0 mg/L and 0.000 500-5.00 mg/L，respective1y，whose average recoveries were 91.4%-105.0%with the RSDs of 1ess than 2.0%. CONCLUSION This rapid，simp1e and sensitivemethod suits the qua1ity contro1of Pudi1an Xiaoyan Tab1ets. KEYWORDS：Pudi1an Xiaoyan Tab1ets；chemica1constituents；UHPLC-MS/MS

R927.2

A

1001-1528（2016）06-1269-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.014

2015-08-07

国家自然科学基金项目 （21264003）

米建萍（1972—），女，硕士，副主任技师，从事理化检验工作。Te1：13507796184，E-mai1：mjp100@sina.com

徐远金 （1964—），男，博士，教授，从事色谱分析方法研究。Te1：（0771）3237743，E-mai1：yjxu@gxu.edu.cn