桑蚕蛹多糖超声提取优化及水溶性多糖组分分析

谭丽鹤， 李红玉（锦州医科大学，辽宁锦州121000）



桑蚕蛹多糖超声提取优化及水溶性多糖组分分析

谭丽鹤， 李红玉*
（锦州医科大学，辽宁锦州121000）

目的 优化桑蚕蛹多糖的超声提取工艺，并采用气质联用 （GC-MS）及红外光谱 （IR）法对水溶性多糖（PSP1）进行组分分析。方法 以多糖得率为指标，采用Box-Behnken设计和响应面法优化超声提取工艺。多糖透析后，树脂柱层析得到水溶性多糖 （PSP1），GC-MS和IR法分析其组分。结果 最佳条件为超声功率760 W，液料比11∶1，提取时间10 min，得率15.28%。PSP1的主要组分为葡萄糖、山梨糖、半乳糖、甘露糖，摩尔比为95.94∶1.59∶1.59∶0.88，而且具有典型的多糖特征吸收峰，并含有吡喃糖。结论 该方法简便快速，多糖得率较高。

桑蚕蛹；多糖；超声提取；水溶性多糖 （PSP1）；组分分析；Box-Behnken设计；响应面法；GC-MS

桑蚕蛹（mu1berry si1k-worm）［1-2］别名小蜂儿，为蚕蛾科动物家蚕蛾的蛹，在我国食用历史悠久，因其含有多糖和丰富的蛋白质，具有提高免疫力、延缓衰老、降血脂、降胆固醇等多重功效，多用于体弱者、老人和孕妇产后恢复。近年来研究显示，多糖具有抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血、免疫调节等生物学功效［3-4］。有文献显示，从桑蚕蛹中提取出的一种水溶性多糖具有抑制HeLa细胞增殖的作用［5］，但是未对其组分进行分析和确定。因此，本实验采用超声波法对桑蚕蛹多糖的提取工艺进行优化，并且对其中具有抗癌活性的多糖进行分离、纯化和鉴定，分析了其单糖组成，以求为寻找天然产物作为肿瘤治疗替代药物的进一步研发提供基础。

1　材料与方法

1.1材料、试剂、仪器

1.1.1材料 桑蚕蛹子实体采自山东省临沂市。G-150葡聚糖凝胶树脂、二乙氨基乙基纤维52树脂、SP131198纤维素透析袋 （上海源叶生物科技有限公司）；葡萄糖为分析纯 （锦州市鑫源化玻有限公司）。

1.1.2试剂 石油醚、三氯甲烷、正丁醇、95%乙醇、重蒸酚、浓硫酸、吡啶、甲醇等均为分析纯（锦州市鑫源化玻有限公司）。

1.1.3仪器 500 g摇摆式中药粉碎机 （温岭市奥力中药机械有限公司）；DHG-9075A鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；UV2550紫外可见分光光度仪 （日本岛津公司）；Sigma高速冷冻离心机 （北京兴达恒信科技有限公司）；GC7890B/ MSG3440B气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；A1pha傅里叶变换红外光谱仪 （纬斯特仪器中国有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1标准曲线的制备 采用苯酚-硫酸法绘制葡萄糖标准曲线，测定多糖含有量［6-8］。精确量取0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液 （制备方法为精密称取于105℃烘干至恒重的葡萄糖0.100 0 g，蒸馏水溶解，定容于100 m L量瓶中。吸取10 mL，置于另一100 mL量瓶中，蒸馏水定容，即得。）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，分别置于比色管中，加蒸馏水至1.0 mL。分别加入1 m L 5%重蒸酚和5 m L浓硫酸，沸水浴加热10 min，待反应完全后冷却至室温，于490 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标 （Y），葡萄糖含有量为横坐标 （X）绘制标准曲线，得回归方程Y=1.293 7X+0.015 6（R2=0.998 6），表明葡萄糖在0.02～0.08 mg/m L范围内线性关系良好。

1.2.2样品的预处理 桑蚕蛹子实体于60℃烘箱中烘干后，粉碎机粉碎，过60目筛。取过筛后的桑蚕蛹粉末适量，索氏提取器按1∶9的比例加入石油醚回流5 h进行脱脂，再经95%乙醇回流提取5 h除去小分子醇溶物，将处理后的蚕蛹粉末于室温下晾干。

1.2.3超声波法提取桑蚕蛹多糖工艺优化［9］称取一定量的预处理后的桑蚕蛹粉末，按一定比例加入0.02 mo1/L NaOH溶液［10］，超声提取2次，合并滤液，HC1溶液调节pH值至中性，旋转蒸发仪浓缩至一定体积后，加入4倍量95%乙醇，置4℃冰箱中过夜。醇沉液于4℃、3 000 r/min条件下离心20 min，干燥得桑蚕蛹粗多糖，计算得率。

1.2.3.1响应曲面法试验设计 根据中心组合试验设计原理，采用3因素3水平的响应面分析法。在单因素试验基础上，以功率 （A）、时间 （B）、液料比 （C）为自变量，确定提取工艺的最佳参数，因素水平见表1。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

1.2.4桑蚕蛹多糖的脱色及除蛋白 将蚕蛹粗多糖用Sevag法除蛋白，4℃下5 000 r/min离心20 min，取上清液反复离心，直至无蛋白层出现为止［11-12］，活性炭脱色，经3层滤纸抽滤以除去活性炭粉末［13-14］。滤液经浓缩、醇沉、干燥，得到除蛋白及脱色后的桑蚕蛹多糖。取0.5 mg/mL样品液于比色管中，加蒸馏水至 1.0 mL，按“1.2.1”项下方法于490 nm波长处测定吸光度，利用回归方程计算脱色、脱蛋白后多糖的含有量，并计算490 nm波长处的保留率及450 nm波长处的脱色率。

计算公式为多糖含有量=纯多糖质量/粗多糖质量×100%，多糖脱色率=（A1-A2）/A1× 100%，多糖保留率=（B1-B2）/B1×100%。其中，A1、A2分别为经脱色、脱蛋白处理前后桑蚕蛹多糖溶液在450 nm波长处的吸光度，B1、B2分别为经脱色、脱蛋白处理前后的桑蚕蛹多糖溶液在490 nm波长处的吸光度。

1.2.5桑蚕蛹多糖的纯化 将脱色、脱蛋白后的多糖用蒸馏水溶解，装入截留相对分子质量5 000 Da的透析袋中，在流动自来水中透析48 h，再置于蒸馏水中透析24 h。将透析后的多糖进行树脂柱层析 （40 mm×400 mm），分别以超纯水和0.2、0.4 mo1/L NaC1溶液为洗脱液，体积流量为0.5 mL/min，每管收集5 mL，苯酚-硫酸法在490 nm波长处测定吸光度［15］，并绘制吸光度-试管数曲线。收集多糖PSP1洗脱液，浓缩、醇沉后于60℃烘箱中干燥。

查阅文献可知，桑蚕蛹水溶性多糖 （PSP1）具有抑制HeLa细胞增殖的作用［5］，并能明显增强B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖，促进小鼠巨噬细胞的吞噬活力和溶血素生成［16］，但尚无化学方面的研究。因此，本实验将在优化提取工艺的基础上，对其组分进行分析。

1.2.6桑蚕蛹多糖PSP1的纯化 将Sephadex G-150树脂于沸水中溶胀2 h后装柱，平衡液平衡层析柱5个柱体积。多糖PSP1经蒸馏水溶解后，上凝胶柱层析 （30 mm×300 mm），以超纯水为洗脱液，体积流量为0.5 mL/min，每管收集5 mL，苯酚-硫酸法在490 nm波长处测定吸光度，并绘制吸光度-试管数曲线，收集洗脱液，浓缩、醇沉后于60℃烘箱中干燥［17］。

1.2.7多糖PSP1的纯度鉴定

1.2.7.1纸层析法 取0.2%PSP1多糖溶液20μL，点样于滤纸（3 cm×20 cm）距端点1 cm处的中部，以正丁醇-乙酸乙酯-吡啶-水 （6∶1∶5∶4）为展开剂，饱和后于室温下展开6 h，通风橱中挥干溶剂。以苯胺-二苯胺为显色剂，于60℃烘箱中放置20 min显色［18］。

1.2.7.2紫外分光光度法 称取少量多糖PSP1，溶解于适量蒸馏水中，紫外可见分光光度计在200～400 nm范围内进行扫描。

1.2.8桑蚕蛹多糖PSP1的组分分析

1.2.8.1多糖的完全酸水解及硅烷化衍生 精密称取桑蚕蛹多糖PSP1 10.0 mg，置于安瓿瓶中，加入3 mL 0.5 mo1/L硫酸溶液，酒精喷灯真空封管，置于110℃烘箱中水解6 h，冷却至室温后加入过量碳酸钡粉末，静置过夜，待其中和至中性后离心，上清液冷冻干燥，即得多糖水解产物，备用［19-21］。将水解产物于60℃下干燥至恒重，加入2 m L无水吡啶，置于80℃烘箱中反应30 min后，加入0.6 mL硅烷化试剂（六甲基二硅胺烷-三甲基氯硅烷为2∶1），摇匀，80℃烘箱中反应10 min［22-23］，过0.22μm有机滤膜，即得衍生化产物，备用。

1.2.8.2气相色谱-质谱分析条件 气相色谱EI源，电子能量70 eV；分子量扫描范围30～600 u；进样口温度210℃；接口温度210℃；载气为氦气；体积流量为1 m L/min；分流比60∶1；程序升温（100℃保持5 min，以25℃/min速率升至210℃，保持14 min，以5℃/min速率升至290℃）；进样量为0.5μL。质谱EI源，电子能量70 eV；溶剂延迟4 min。

1.2.9红外分析 称取干燥至恒重的桑蚕蛹多糖PSP1 1 mg，置于洁净的玛瑙研钵中，红外灯下研磨成粉，加入200 mg干燥的KBr粉末，研磨至两者完全混合均匀。将混合物置于洁净的压片模具中，组装好后进行压片，制成透明薄片。以空气为空白，将薄片装在样品架上，置于样品室中，在400～4 000 cm-1区间内进行红外光谱扫描，先测定空白背景，再测定样品的红外光谱，进行修正后观察谱峰情况［24-25］。

2　结果与分析

2.1Box-Behnken试验设计与结果 见表2。

表2　试验设计及结果Tab.2 Design and resu lts of tests

根据表2结果，利用Design Expert8.0软件对数据进行二次回归分析，得到回归方程Y= 13.63+2.28A+1.50B-0.88C+0.54AB-1.19AC-0.38BC-2.87A2-0.98B2-1.34C2，方差分析见表3。由表可知，回归方程模型的P＜0.000 1，高度显著；R2为0.978 4，与实验拟合较好，符合度达97.84%，可靠性高，线性关系显著；R2adj值为0.950 7，能够解释95.07%响应值的变化，进一步证明其可靠性。另外，功率和时间对多糖得率影响较大，尤其以功率最为显著，影响程度依次为功率＞时间＞液料比。

2.2响应面曲线图 由图1可知，功率较低时，得率随时间和液料比的增加而提高，但功率较大时反而降低，即与功率和液料比有关，而且稳定点都落在范围内，表明两者的交互作用对得率也有影响。液料比较低时，得率随时间的增加而提高。时间较长时，得率随液料比的增加而呈降低趋势。经软件分析预测，该模型得率为15.53%，最优提取条件为超声功率764.60 W，时间10.00 min，液料比11.22∶1。结合实际操作，将其修正为超声功率760 W，时间10 min，液料比11∶1。为验证结果的可靠性，按上述条件设计3次平行验证实验，测得桑蚕蛹多糖平均得率为15.28%，与预测值接近，说明该模型准确可靠。

表3　方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.3桑蚕蛹多糖的纯化 经过石油醚脱脂、水提醇沉、Sevag法除蛋白、活性炭脱色后，得到浅黄色的桑蚕蛹粗多糖，其含有量为82.34%，脱色率为60.90%，保留率为49.68%。粗多糖经截留分子量5 000μ的透析袋透析，经DEAE-52树脂纯化。由图2可知，多糖PSP1的峰值最高，而且峰形对称。

2.4 桑蚕蛹多糖PSP1的纯化及鉴定 Sephadex G-150树脂柱层析的紫外图谱 （图3）显示为单一的洗脱峰，洗脱曲线峰形对称，表明多糖纯度较高，分子量分布较均一。该多糖在纸层析上显示为单一斑点，说明为单一组分。在260 nm和280 nm波长处没有吸收峰，表明不含核酸和蛋白质。

2.5桑蚕蛹多糖PSP1的组分分析 桑蚕蛹多糖PSP1经硫酸酸解及硅烷化衍生后，再经气相色谱-质谱 （GC-MS）检测，供试品各峰保留时间与NIST谱库对照结果见表4、图4。由表可知，PSP1中有4种单糖，匹配度均在85%以上，以葡萄糖为主，其比例为95.94∶1.59∶1.59∶0.88。

图1　响应面曲线图Fig.1 Response surface curves

图2　DEAE-52树脂柱纯化多糖Fig.2 Purification of polysaccharides by DEAE-52 resin column

图3　G-150葡聚糖凝胶柱纯化多糖PSP1Fig.3 Purification of polysaccharide PSP1 by Sephadex G-150 colum n

表4　组分分析结果Tab.4 Resu lts of component analysis

2.6红外光谱解析 由图5可知，3 600～3 200 cm-1处有一个较宽的吸收峰，为氢键中O-H键的伸缩振动峰；2 926.01 cm-1为C-H键的伸缩振动峰；1 419.61 cm-1为C-H键的变角振动吸收峰，由此可判断 PSP1为 多 糖［26-27］。1 653.00 cm-1为O-H键的弯曲振动峰；1 384.89～1 419.61 cm-1为 C-H键的弯曲振动峰；1 026.13、1 080.14、1 151.50 cm-1为C-O键的伸缩振动峰；1 026.13、1 080.14 cm-1为吡喃糖环的特征吸收峰；869.90 cm-1为β-D-甘露吡喃糖苷δC-H键的振动峰［28-29］。

3　讨论

本实验通过响应面法优化桑蚕蛹多糖的超声提取工艺，发现最优条件为超声功率760 W，时间10min，液料比11∶1，平均收率为15.28%。采用硫酸酸解、硅烷化法对PSP1进行衍生，GC-MS显示其单糖组分为葡萄糖、山梨糖、半乳糖和甘露糖，比例95.94∶1.59∶1.59∶0.88。今后，还将采用高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应、质谱、核磁共振等方法对其结构进行深入研究。

图4　GC-MS总离子流图Fig.4 GC-MS total ion current chromatogram

图5　红外光谱图Fig.5 Infrared spectrum

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Optim izing the ultrasonic extraction of polysaccharides from mulberry silkworm pupa and analyzing the water-soluble polysaccharide

TAN Li-he， LIHong-yu*

（Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China）

AIM To optimize the u1trasonic extraction of po1ysaccharides from mu1berry si1kworm pupa and to ana1yze the components of water-so1ub1e po1ysaccharide（PSP1）by gas chromatography-mass spectrometer（GCMS）and infrared spectroscopy（IR）.METHODS With the po1ysaccharide yie1d as amode1 for eva1uation，the u1trasonic extraction was optimized by Box-Behnken design and response surface method.After dia1ysis，PSP1 stratefied by the resin co1umn was qua1ified and quantified by GC-MSand IR.RESULTS At the highest po1ysaccharide yie1d of 15.28%，the best conditions were 760 W for u1trasonic power，11∶1 for 1iquid-so1id ratio，and 10 min for extraction time.Themain components of PSP1，presenting the typica1 characteristic absorption peaks of po1ysaccharides，were determined to be g1ucose，sorbito1，ga1actose andmannose at themo1ar ratio of95.94∶1.59∶1.59∶0.88，and with a concomitant pyranose.CONCLUSION This simp1e and rapid method can produce a high yie1d of po1ysaccharides.

mu1berry si1kworm pupa；po1ysaccharides；u1trasonic extraction；water-so1ub1e po1ysaccharide（PSP1）；componentana1ysis；Box-Behnken design；response surfacemethod；GC-MS

R284.2

A

1001-1528（2016）06-1254-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.011

2015-12-01

谭丽鹤 （1991—），女，硕士，研究方向为药剂学。Te1：18841622145，E-mai1：1402334040@qq.com

李红玉 （1956—），女，博士，教授，博士生导师，研究方向为载体栓剂及新药开发。E-mai1：1ihongyu@163.com