Box-Behnken响应面法优化组织破碎提取龙胆苦苷

程振玉， 杨英杰， 成乐琴， 于丽颖， 沈启慧， 张 俭（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022）



Box-Behnken响应面法优化组织破碎提取龙胆苦苷

程振玉， 杨英杰*， 成乐琴， 于丽颖， 沈启慧， 张 俭
（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022）

目的 采用Box-Behnken响应面法优化组织破碎提取龙胆苦苷。方法 以龙胆苦苷提取率为指标，在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken响应面法对提取工艺进行优化。结果 最佳条件为药材粒径80目，料液比1∶30，电压150 V，乙醇体积分数70%，提取时间35 s，龙胆苦苷提取率达到5.37%。结论 该方法快速高效，可显著缩短提取时间，增加龙胆苦苷的提取率。

龙胆苦苷；组织破碎；提取工艺；Box-Behnken响应面法

龙胆草Gentiana scabra Bge.又名龙胆或地胆草，为龙胆科龙胆属植物龙胆的根或茎部［1］，主要分布在吉林、辽宁、黑龙江和内蒙古等东北地区。药理研究表明，其生物药效物质基础主要为龙胆苦苷，该成分在抑制恶性肿瘤形成、消除炎症、促进健胃消食、抗病原微生物、抗氧化和镇痛等方面发挥了重要作用，显示出明显的药理活性［2-4］。因此，研究龙胆苦苷的提取方法，使其提取率最大程度增加，对相关新药研发具有重要的现实意义。

龙胆苦苷的传统提取技术大多采用回流法或连续回流法［5-6］，耗时长，温度高，而且提取率低，严重影响了这一药用资源的充分利用。近几年随着提取技术的不断发展与完善，组织破碎法［7-8］等新方法已逐步应用到天然产物化学研究领域，在中药药理成分提取和样品前处理中发挥了显著作用，可大幅缩短提取时间，减少溶剂用量，而且目标产物提取率明显增加［9］，但迄今鲜有运用该方法对龙胆草中龙胆苦苷进行提取的研究报道。响应面法是一种对工艺参数进行优化的有力手段和技术，在改善精度、提高预测性、简便准确处理大量数据方面，具有正交试验等一般方法无法比拟的优点，在中草药、食品、化学化工等领域的应用越来越广泛［10-11］。本实验在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面法进行设计，并对组织破碎法提取龙胆苦苷的工艺进行优化，为工业化进一步生产该成分提供新的数据支撑。

1　材料与方法

1.1材料与试剂 龙胆苦苷对照品 （批号MUST-14052205，四川成都曼斯特生物科技有限公司）。甲醇、乙腈均为色谱纯；乙醇为分析纯；水为去离子水。龙胆草购自吉林省通化市 （产地长白山），由本校环境与生物工程学院隋新副教授鉴定为正品。

1.2仪器与设备 P230型高效液相色谱仪，配有UV-230紫外检测器 （大连依利特分析仪器有限公司）；FA1004型电子天平 （上海舜宇恒科仪器有限公司）；SY-800超声波清洗器 （上海宁商超生仪器有限公司）；JHBE-50S型闪式提取器（河南金鼎科技发展有限公司）；RT-08型多功能粉粹机 （荣聪精密科技有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D型循环水式真空泵 （河南省巩义市英峪仪器一厂）。

1.3方法

1.3.1HPLC条件 Hypersi1ODS C18色谱柱（4.6 mm× 250mm，5μm）；进样量20μL；体积流量1.0 mL/min；检测波长270 nm；柱温25℃；流动相乙腈 （A）-0.4%磷酸 （B），梯度洗脱 （0～10 min，5% ～28%A；10～16 min，28%～30%A；16～16.1 min，30%～100%A，保持14min；30～30.1min，100%～5%A，保持15min）。

1.3.2标准曲线的绘制 取置于干燥器中48 h以上的龙胆苦苷标准品，精密称取11.40 mg，甲醇溶解，摇匀，定容到25 mL量瓶中，得到456.0μg/mL标准品贮备液。吸取适量，连续稀释，得到456.0、342.0、228.0、114.0、57.0、28.5、9.12μg/m L溶液，在 “1.3.1”项条件下进行分析。

1.3.3单因素试验 将干燥龙胆苦苷粉碎，过不同孔径筛子。精密称取5.0 g，平行3份，按照一定料液比加入不同体积分数的乙醇，置于闪式提取器中，在一定的电压下提取一段时间。提取结束后，将所得混合液进行抽滤，除去龙胆药渣，滤液置于500 m L量瓶中，适量提取溶剂清洗提取器刀头和药渣，洗涤液继续抽滤，滤液转移到量瓶中，适量提取剂定容，摇匀，得到一定质量浓度的龙胆苦苷提取液。吸取少量，过0.45μm尼龙微孔滤膜，进样，HPLC法分析含有量，考察料液比、提取电压、乙醇体积分数、药材粒径、提取时间等因素对龙胆苦苷提取率的影响。

1.3.4组织破碎法提取龙胆苦苷的响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面法，对提取工艺作进一步优化。因素水平见表1。

表1　因素水平

2　结果与分析

2.1HPLC色谱图与标准曲线 在“1.3.1”项条件下，基线无漂移现象，峰形不扩张、不拖尾，目标组分龙胆苦苷与共存杂质得到了良好的分离，而且出峰相对较早，分析时间适宜，见图1。以龙胆苦苷峰面积 （Y）对其质量浓度（μg/mL，X）回归，得到标准曲线方程 Y= 15.451 X+117.62，R2=0.999 9，表明龙胆苦苷在9.12～456.0mg/mL范围内呈良好的线性关系。

图1　HPLC色谱图

2.2单因素试验结果

2.2.1电压对龙胆苦苷提取率的影响 固定药材粒径100目、料液比1∶20、乙醇体积分数100%、提取时间30 s，电压对龙胆苦苷提取率的影响见图2。由图可知，电压从90 V变化到150 V时，提取率急剧增加；超过150 V后，提取率增加趋势变缓，可能是因为电压越高，闪式提取器内刃转速越高，显著增加内刃与外刃间的切割作用，促进药材的破碎，同时切割作用会使内刃中心产生强力涡流，促进整个体系处于剧烈搅拌之中，从而加速目标成分在从细胞组织扩散到提取剂中的速率［12］。但电压过高会严重影响电机，故从降低能耗和保护设备的角度综合考虑，选择150 V作为最佳电压。

图2　电压对龙胆苦苷提取率的影响

2.2.2药材粒径对龙胆苦苷提取率的影响 固定电压150 V、料液比1∶20、乙醇体积分数100%、提取时间30 s，药材粒径对龙胆苦苷提取率的影响见图3。由图可知，在粒径小于80目时，提取率随药材粒径的减小而急剧增加，但粒径进一步减小后无明显变化，这可能是由于闪式提取器的破碎刀头在设计时把破碎粒径控制在一定范围。目数越大，粒径越小，与适当溶剂混合后，在剧烈搅拌和和振动作用下，药材中的目标成分能快速转移到提取剂中，但粒径过小时会增加后续的过滤的难度。因此，选择80作为最佳粒径。

图3　药材粒径对龙胆苦苷提取率的影响

2.2.3乙醇体积分数对龙胆苦苷提取率的影响 固定电压150 V、料液比1∶20、药材粒径80目、提取时间30 s，乙醇体积分数对龙胆苦苷提取率的影响见图4。由图可知，当乙醇体积分数低于80%时，提取率随着其增大而逐渐上升；进一步增加乙醇体积分数，提取率反而降低，这可能是由于乙醇渗透能力强于水，故乙醇体积分数提高能加速目标成分在提取剂和细胞基质之间的溶解平衡；乙醇体积分数越高，提取剂极性越小，而龙胆苦苷是极性分子，根据相似相溶原理，其溶解度将会减小，从而降低提取率。因此，选择80%～100%作为乙醇最佳体积分数。

图4　乙醇体积分数对龙胆苦苷提取率的影响

2.2.4提取时间对龙胆苦苷提取率的影响 固定电压150 V、料液比1∶20、药材粒径为80目、乙醇体积分数80%，提取时间对龙胆苦苷提取率的影响见图5。由图可知，在40 s前，提取率逐渐增加；40 s后，提取率反而急剧减小，这可能是由于经过长时间提取后，提取器破碎刀头内外刀刃间产生许多热量，溶液温度逐渐升高，超过一定温度后龙胆苦苷被氧化，导致结构改变。因此，选择20～40 s作为最佳提取时间。

图5　提取时间对龙胆苦苷提取率的影响

2.2.5料液比对龙胆苦苷提取率的影响 固定电压150 V、提取时间40 s、药材粒径80目、乙醇体积分数80%，料液比对龙胆苦苷提取率的影响见图6。由图可知，当料液比由1∶10增加到1∶30时，提取率逐渐增加；进一步增加溶剂用量，提取率反而急剧降低，这可能是因为随着提取剂用量不断增加，小粒径药材与提取器破碎刀头相互接触的概率越来越小，从而引起刀头剪切几率下降，最终导致龙胆苦苷提取不完全。因此，选择1∶20～1∶40作为最佳料液比。

2.3Box-Behnken响应面分析

2.3.1模型建立及显著性检验 采用Design-Expert 8.0软件设计响应面试验，结果见表2。

图6　料液比对龙胆苦苷提取率的影响

表2　试验设计与结果

对表2数据进行拟合，得到回归方程：Y=5.48+5× 10-3A-0.055B-0.020C+0.070AB-0.015AC-0.060BC-0.29A2-0.11B2-0.30C2。方差分析见表3。

表3　方差分析

由表3可知，该模型的F值为6.15，P值为0.012 8（小于0.05），表明该模型显著。A2和C2项均表现出了非常显著的作用 （P＜0.05），但其他因素影响不明显 （P＞0.05），故料液比、提取时间与乙醇体积分数对提取率的影响未呈现一般线性相关性，相互影响作用非常小，可不予考虑［13］。失拟项F值为3.24，P值大于0.05，表明不存在异常点，模型无误，不必引入更高次数的项进行研究。R2=88.78%，表明试验中88.78%的数据可以用该模型来解释［14］。综上所述，该模型可靠性与准确性较高。

2.3.2提取工艺的响应曲面分析与优化 为了更简明地表现2个考察因素同时对目标成分提取率的影响，可令其它因素水平值为零［15］，将3个因素中的1个取零水平，分析另2个因素对响应值的影响。结果见图7。

图7　响应面图

由图可知，料液比、乙醇体积分数和提取时间对龙胆苦苷的提取率都有影响。但是，图中曲线坡度均较小，变化缓慢，说明三者对龙胆苦苷提取率的影响不显著。

采用Design-Expert软件对参数作进一步优化，得到最优条件为料液比1∶29.77，提取时间34.73 s，乙醇体积分数69.93%。在此条件下，龙胆苦苷提取率达到5.49%。考虑操作可行性和简便性，最终确定为料液比1∶30，加入70%乙醇150 mL，在150 V电压下提取35 s。

2.4最佳试验条件的结果验证 精密称取样品5.0 g，在最佳工艺下进行提取，平行3次。结果，龙胆苦苷提取率达到5.37%，与响应面预测值 （5.49%）相当，表明该模型合理，试验结果理想。

2.5不同方法提取龙胆苦苷的比较 为了进一步对该工艺进行验证，本实验将其与传统回流法［16］进行比较，文献报道的最佳工艺为称取样品5.0 g，加入50 mL 70%乙醇，71.5℃下提取3 h，龙胆苦苷提取率为4.96%。由此可知，本实验建立的方法耗时更短，能耗更低，而且提取率明显增加。

3　结论

组织破碎法作为一种新型提取工艺，因具有操作简便、时间短、能耗低、提取率高等特点而广泛应用于中草药活性成分提取，本实验采用该技术实现了龙胆草中有效成分龙胆苦苷的高效提取，确定最佳工艺条件为按照1∶30料液比加入70%乙醇，在150 V电压下提取35 s，龙胆苦苷提取率达到5.37%。与传统回流法相比，不仅提取时间明显减少，而且提取率显著提高，故该技术为工业生产中龙胆苦苷的提取提供了新的数据支撑和理论依据。

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R284.2

B

1001-1528（2016）06-1408-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.045

2015-04-10

吉林省教育厅科技计划项目 （吉教科合字 ［2006］88号）

程振玉 （1986—），男，硕士生，助教，从事天然产物化学和有机分析研究。Te1：15843289508，E-mai1：chengzhenyu0633@ 126.com

杨英杰 （1955—），男，教授，从事精细有机化学合成与应用研究。Te1：13843228673，E-mai1：yanghjm@163.com