罗布麻提取物对急性脑缺血大鼠血脑屏障的保护作用和机制

张 雯， 蔡 敏， 余忠海， 向 军， 蔡定芳*（.复旦大学附属中山医院中西医结合科，上海200032；2.上海中医药大学附属龙华医院神经内科，上海200032）



罗布麻提取物对急性脑缺血大鼠血脑屏障的保护作用和机制

张 雯1， 蔡 敏1， 余忠海1， 向 军2*， 蔡定芳1*
（1.复旦大学附属中山医院中西医结合科，上海200032；2.上海中医药大学附属龙华医院神经内科，上海200032）

目的 观察罗布麻提取物的急性脑缺血后血脑屏障的保护作用及其机制。方法 60只雄性SD大鼠随机分为5组：假手术组 （sham），模型组 （I/R），罗布麻提取物小、中、大 ［125、250、500 mg/（kg·d）］剂量组。采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血损伤模型，1.5 h后拔出线栓实施再灌注。采用TTC染色于缺血再灌注24 h计算脑梗死面积百分比；参照Zea Longa评分标准于缺血再灌注24 h进行神经功能缺损评分；透射电镜检测血脑屏障超微结构变化；采用Western b1ot检测基质金属蛋白酶-9/-2的表达。结果 罗布麻提取物能显著减少脑梗死面积百分比，改善神经功能缺损。抑制脑缺血后基质金属蛋白酶-9/-2的表达和活性。结论 罗布麻提取物可能通过抑制脑缺血后基质金属蛋白酶-9/-2的表达和活性而减轻血脑屏障损伤，进而减少脑梗死，促进神经功能改善。

罗布麻提取物；脑缺血再灌注；血脑屏障；基质金属蛋白酶-9/-2

罗布麻Apocynum venetum L.属夹竹桃科植物，生长于我国华北、西北及黄河流域的河滩、草滩、盐碱沙荒环境中，以干燥叶入药，药典记载其性味甘、苦、凉，归肝经，具有平抑肝阳、清热利水等功效［1］。现代研究表明其具有较好的神经保护作用［2］，但其对血脑屏障的保护作用尚不明确。我们拟利用脑缺血损伤大鼠模型，观察其对急性脑缺血后血脑屏障的保护作用和机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 清洁级雄性SD大鼠60只，3月龄，体质量280～300g，由上海中国科学院实验动物研究中心提供，使用许可证号：SCXK（沪）2002-0010号。

1.1.2药物与试剂 罗布麻提取物 （由日本河汉生药研究所提供）；兔抗鼠基质金属蛋白酶-9/-2（Idun Pharmaceutica1s，美国）；兔抗鼠β-Actin、HRP羊抗兔IgG（Ce11Signa1ing Techno1ogy，美国）；兔抗鼠Active Caspase-8（Santa Cruz Biotechno1ogy，美国）；TTC（2，3，5-tripheny1 tetrazo1ium ch1oride，TTC，Sigma，美国）；ECL发光试剂盒（Pierce，美国）。

1.2方法

1.2.1动物分组与给药 将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组，模型组，罗布麻提取物小 ［125 mg/（kg·d）］、中 ［250mg/（kg·d）］、大剂量组 ［500mg/（kg·d）］。大鼠适应环境3 d后开始给药，每天给药1次，连续给药7 d，在给药第8天造模。造模后继续给药，持续到大鼠被处死。罗布麻提取物组分别给予不同剂量的罗布麻提取物，假手术组和模型组给予等剂量的生理盐水。

1.2.2 脑缺血模型的建立 SD大鼠术前12 h禁食，10%水合氯醛腹腔注射 （350 mg/kg，i.p.），麻醉后仰卧位固定，参照Zea Longa［3］等的大脑中动脉线栓法，造成右侧大脑中动脉阻塞，缺血1.5 h后，拔出线栓实现再灌注。

1.2.3神经功能缺损评分 大鼠于缺血1.5 h再灌注24 h进行神经功能缺损评分，每组取5只大鼠进行观察。参照Zea Longa［3］等的五级4分制：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。

1.2.4脑梗死面积测定 神经功能缺损评分完毕后，深度麻醉，断头取脑组织，切成5个连续冠状切片。于1%TTC染液中37℃避光水浴15 min。拍照后软件（Image Pro P1us，IPP 6.0）统计分析，计算脑梗死面积百分比。

1.2.5透射电镜 大鼠于缺血1.5 h再灌注24 h检测血脑屏障超微结构，每组取3只大鼠。深度麻醉，经心脏灌注3%多聚甲醛+1%戊二醛固定液300 mL后取材，放置于2.5%戊二醛溶液（0.1 mo1/L PB缓冲液，pH 7.4配制）后固定24 h后，置于2%Osmium固定1.5 h，经脱水，环氧树脂812包埋液浸透包埋，超薄切片钻石刀将组织切成0.06μm的切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色后保存。透射电镜下观察血脑屏障的亚显微结构并拍片。

1.2.6蛋白定量分析 采用Western b1ot法检测血脑屏障损伤相关蛋白的表达，每组取4只大鼠。大鼠缺血再灌注24 h，取缺血侧皮层脑组织，提总蛋白。品经SDS凝胶电泳后转膜，牛血清白蛋白封闭，与相应一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL反应1 min，曝光、显影，光密度定量分析，β-Actin作为内参。

1.2.7统计分析 采用SPSS 11.5对数据进行处理，计量资料数据以±s表示，采用Levene法进行方差齐性检验，多组间用单因素方差分析，两组间用两样本t检验。以P＜ 0.05为具有统计学意义。

2　结果

2.1罗布麻提取物对急性脑缺血大鼠神经功能缺损评分的影响 表1所示，模型组神经功能评分明显高于假手术组，经250、500mg/（kg·d）罗布麻提取物预处理的大鼠神经功能缺损评分明显优于模型组大鼠 （P＜0.05）。结果提示大、中剂量罗布麻提取物改善局灶性缺血再灌注后的神经功能损害。

表1　脑缺血1.5 h再灌注24 h的神经功能缺损评分

2.2罗布麻提取物对急性脑缺血大鼠脑梗死面积百分比的影响 大鼠脑缺血1.5 h再灌注24 h的TTC染色，模型组大鼠可见大面积的白色梗死区，250、500 mg/（kg·d）罗布麻提取物预处理的大鼠的梗死面积则较小，如表2所示，统计学分析表明大、中剂量罗布麻提取物能显著减少脑梗死面积百分比 （P＜0.05）。

表2　脑缺血1.5 h再灌注24 h的神经功能缺损评分

图1　罗布麻提取物对急性脑缺血大鼠血脑屏障超微结构的影响

2.3罗布麻提取物对急性脑缺血大鼠血脑屏障超微结构的影响 如图1所示，假手术组 （图1A1、A2）大鼠皮层血脑屏障结构正常，微血管形态规则，基底膜连续，内皮细胞、星形胶质细胞足突结构均正常。脑缺血1.5 h再灌注24 h，模型组大鼠 （图1B1、B2）血管管腔受压变窄，毛细血管周围水肿明显，或呈空泡性改变。血管内皮细胞间紧密连接开放或消失。罗布麻提取物大剂量组 （图1C1、C2）亦可见血脑屏障亚显微结构改变，但毛细血管内皮完整，管腔正常，基底膜连续，微血管周围水肿，星形胶质细胞足突水肿均较模型组减轻。

2.4罗布麻提取对急性脑缺血大鼠基质金属蛋白酶MMP-9/-2表达的影响 如图2所示，与假手术组比较，脑缺血1.5 h再灌注24 h模型组大鼠MMP-9/-2的表达均显著上升，而大剂量罗布麻提取物预处理可明显下调二者的表达。

图2　大剂量罗布麻提取物对MMP-9/-2的表达的影响

3　讨论

我们首先通过神经功能缺损评分、脑梗死面积百分比评定了不同剂量罗布麻提取物的脑缺血保护作用，结果发现大、中剂量罗布麻提取物 ［500、250 mg/（kg·d）］具有显著的脑缺血保护作用。随后我们选取最优剂量的罗布麻提取物观察其对血脑屏障的保护作用和机制。

血脑屏障由微血管内皮细胞、基底膜、周细胞、星形胶质细胞终足突绕构成，是血与脑组织间复杂的动态屏障，维持脑组织的稳态，保证了神经元正常功能活动［4-5］。急性脑缺血可对其结构成分造成损伤，血脑屏障通透性增加，导致血管源性脑水肿或向脑出血转换而加重脑损伤［6-7］。因此，脑缺血后血脑屏障超微结构的变化是重要的评价指标之一［8-9］。我们应用透射电镜证实急性脑缺血再灌注后血脑屏障超微结构改变，微血管周围水肿严重，星形胶质细胞足突水肿明显，微血管被挤压，而罗布麻可显著减轻脑缺血再灌注导致的血脑屏障形态学改变。

导致血脑屏障破坏的因素和机制复杂，其中基质金属蛋白酶是目前关注的热点之一。中枢神经系统的血管内皮细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞表达金属基质蛋白酶，可攻击并降解细胞外基质，内皮细胞间紧密连接和基底膜导致血脑屏障破坏［5，7，10］。目前已证实，MMP-9、MMP-2在脑缺血再灌注时表达上调，降解紧密连接蛋白导致血脑屏障完整性破坏，二者也被认为是血脑屏障损伤的标志物之一［11-14］。我们的研究发现罗布麻提取物显著下调脑缺血后MMP-9/-2的表达，提示与二者可能是罗布麻的血脑屏障保护作用靶点。

综上所述，罗布麻可保护急性脑缺血再灌注后血脑屏障破坏，从而减少脑梗死，促进神经功能改善，作用机制可能与其下调MMP-9/-2的表达有关。

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R285.5

B

1001-1528（2016）06-1387-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.039

2015-03-27

国家自然科学基金资助项目 （81202813）

张 雯 （1985—），男，硕士，住院医师，研究方向为中西医结合神经病学。Te1：（021）64041990-3444，E-mai1：zhang. wen1@zs-hospita1.sh.cn

向 军 （1982—），男，博士，主治医师，研究方向为中西医结合神经病学。Te1：（021）64041990-3444，E-mai1：xiang. jun@zs-hospita1.sh.cn蔡定芳 （1956—），男，博士，主任医师，研究方向为中西医结合神经病学。Te1：（021）64041990-3444，E-mai1：cai. dingfang@zs-hospita1.sh.cn