藜欢解郁胶囊的抗抑郁作用

刘 梅， 周海松， 许锦文， 李 萍， 奉建芳*（.上海中医药大学中药产学研合作中心，上海00；.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海00；.广西中医药大学药学院药理教研室，广西南宁5000；）



藜欢解郁胶囊的抗抑郁作用

刘 梅1， 周海松2，3， 许锦文2， 李 萍3， 奉建芳2*
（1.上海中医药大学中药产学研合作中心，上海201203；2.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海201203；3.广西中医药大学药学院药理教研室，广西南宁530001；）

目的 探讨藜欢解郁胶囊 （蒺藜、合欢花、石菖蒲、甘草）抗抑郁的作用及其相关机制。方法 运用慢性应激性刺激加孤养法造成大鼠抑郁模型，观察大鼠体质量、皮毛、饮食、排泄、强迫游泳不动时间和悬尾不动时间；用酶联免疫吸附法 （ELISA法）观察藜欢解郁胶囊对大鼠血清去甲肾上腺素 （NE）、多巴胺 （DA）、5-羟色胺 （5-HT）及皮质酮 （CORT）含有量的影响；用蛋白质印迹法观察藜欢解郁胶囊对大鼠脑内海马体脑源性神经营养因子 （BDNF）蛋白表达水平的影响。结果 与空白组比较，模型组动物造模后体质量增长缓慢 （P＜0.01），动物皮毛出现干枯、斑秃、不思饮食、不喜活动等情况。与模型组比较，各给药组动物体质量增加明显 （P＜0.05），饮食、皮毛等较正常。藜欢解郁胶囊低、高剂量组能明显缩短大鼠的强迫游泳不动时间和悬尾不动时间 （P＜0.05或P＜0.01），升高抑郁大鼠血清中NE、DA、5-HT的含有量及脑内海马BDNF蛋白的表达水平（P＜0.05或P＜0.01），降低血清中CORT的含有量 （P＜0.01）。结论 藜欢解郁胶囊有抗抑郁作用，其作用机制可能是通过提高单胺类神经递质功能，抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴功能，提高脑内海马BDNF的表达水平，升高5-HT含有量，保护5-HT能神经元功能等途径发挥抗抑郁作用。

藜欢解郁胶囊；抗抑郁；单胺类神经递质；脑源性神经营养因子

抑郁症是一种常见的精神障碍性疾病，以焦虑不安和情绪低落为主要特征，同时伴有思维迟钝、注意力和学习记忆力下降、意志活动减弱或持续显著的紧张不安伴自主神经功能兴奋等症状［1-2］。

目前常见的抗抑郁药物包括三环和四环类抗抑郁剂，单胺氧化酶（MAO）抑制剂，选择性5-HT重吸收抑制剂，非典型抗抑郁药 （SSRI）等。尽管其起效快、用药量少，但长期服用都有一定的毒副作用。如临床最常见的选择性5-HT重吸收抑制剂盐酸氟西汀 （百忧解），很多病人因其恶心、呕吐或食欲减退等不良反应，而放弃治疗，以致病情进一步恶化［3］。

中药具有疗效好、毒副作用低、较少的依赖性，以及不存在停药后高复发或反跳作用等特点，近年来在抑郁症的防治方面发挥了重要作用［4-5］。藜欢解郁胶囊来源于临床验方，前期的实验表明该胶囊具有明确的抗抑郁的药效。本文拟通过行为学观察结合分子生物学相关方法初步探讨其抗抑郁的药效及相关作用机制。

1　材料

1.1仪器 FA1604型电子分析天平（上海上天精密仪器有限公司）；大鼠旷场反应箱 （自制，高25～30 cm，底边长40 cm，内壁涂黑，底面平均分为25个小方格）；RE2000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Tecan Infinite F50酶标仪（美国Dickson）；DL-P14洗片机（苏州市德利影像设备科技有限公司）；Powerpac通用标准湿式转膜仪（美国Bio-Rad）；Powerpac通用标准蛋白质电泳仪（美国Bio-Rad）；Centrifuge 5810R超速低温离心机（德国Eppendorf）；JY92-ZD超声波细胞粉碎机 （上海江莱生物科技有限公司）。

1.2 试剂与药品 95%乙醇 （分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20111228）；浓盐酸 （国药集团化学试剂有限公司，批号20100426）；甘油 （国药集团化学试剂有限公司，批号F20110411）；Tween-20（国药集团化学试剂有限公司，批号F20100302）；甲醇 （国药集团化学试剂有限公司，批号T20111214）；NaC1（国药集团化学试剂有限公司，批号20110422）；考马斯亮蓝显色剂 （美国Bio-Rad公司，批号5000006）；甲叉双丙烯酰胺Bic（美国Amresco公司，批号0172）；SDS（美国Amresco公司，批号0227）；过硫酸铵AP（美国Amresco公司，批号A0486）；四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司，批号T8133）；溴酚蓝（美国Amresco公司，批号0449）；硝酸纤维素膜 （上海依科赛生物制品有限公司，批号CS011-0001）；ECL化学发光显色剂 （上海优宁维生物科技有限公司，批号WBKLS0500）；一抗BDNF（H-117）200μg/mL（美国Santa cruz公司，批号sc-20981）；丙烯酰胺Acr（美国Amresco公司，批号0341）；甘氨酸（美国Amresco公司，批号0167）；Tris base（美国Sigma公司，批号93349）；beta-巯基乙醇（美国Sigma公司，批号BY-12286）；二抗（山羊抗兔1gG）（上海碧云天生物技术研究所，批号A0208）；苯甲基磺酰氟PMSF（上海碧云天生物技术研究所，批号ST506）；RIPA裂解液 （上海碧云天生物技术研究所，批号P0013B）；Western b1ot Mark（上海杰瑞生物工程有限公司，批号SM0671）；Western b1ot内参GADPH（上海康成生物科技有限公司，批号KC-5G5）；大鼠皮质酮、5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺ELISA试剂盒 （上海蓝基生物科技有限公司，批 号 分别 为E02C0066、E02H0202、E02N0013、E02D0002）；胶片 （柯达）；牛血清蛋白BSA；脱脂奶粉；显影液和定影液；藜欢解郁胶囊 （由蒺藜、合欢花、石菖蒲、甘草4味药组成，全方水提，提取液浓缩干燥加入木糖醇等辅料制粒，装胶囊即得，上海中药制药技术有限公司制备，批号20120401）

1.3动物 Wistar大鼠（SPF级）体质量180～220 g，购自上海西普尔一必凯试验动物有限公司 （合格证号SCXK［沪］2008-0016），动物饲养于上海中医药大学动物实验中心 （使用许可证号 SYXK［沪］2009-0069），标准环境：温度 （22±1）℃，相对湿度 （60±5）%，人工光照，12 h明暗周期，自由摄食、饮水，开始实验。

2　方法

2.1动物分组、给药及造模 Wistar大鼠40只，雄性，适应性饲养1周后随机分5组，每组8只，即空白对照组（生理盐水NS，10 mL/kg），模型对照组 （NS，10 mL/ kg），阳性对照组 （盐酸氟西汀胶囊，2.8 mg/kg），藜欢解郁胶囊高、低剂量组 （2.35、1.18 g/kg）。利用单笼饲养和长期不可预见性温和应激建立慢性应激大鼠抑郁模型（8种应激因子按随机分布表随机安排到24 d中，平均每种刺激各2～3次，同一种刺激连续出现时间不超过2 d：①昼夜颠倒 （24 h）；②禁食 （24 h）；③潮湿垫料 （将200mL水加入有锯木屑和大鼠粪便的笼底，24 h）；④鼠笼倾斜，摇晃 （速率1次/s 15min）；⑤40℃高温环境 （5 min）；夹尾 （1min）；⑥4℃冰水游泳 （5min）；⑦陌生异常物品 （如塑料杯、木勺等）；⑧禁水24 h，除正常组外，各组大鼠均单笼饲养并按程序给予应激刺激。于造模后第3 d开始，每日上午9∶00～10∶00灌胃1次，给药容量为10mL/kg，连续灌胃给药21 d。

2.2指标测定

2.2.1药物对大鼠体质量，饮食，毛发，排泄的影响 分别于给药前，给药后5 d，给药后10 d，给药后15 d，给药后20 d称量各组动物体质量。每天观察动物饮食，排泄，毛发情况。

2.2.2大鼠强迫游泳实验 第21天给药后1 h进行实验。实验前大鼠训练游泳10 min，24 h后测试：大鼠单只放入盛水容器中 ［40 cm×18 cm，水深18 cm；水温 （23± 2）℃］，记录5min内累计不动时间 （s）（所谓不动是指动物在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面）。

2.2.3大鼠悬尾实验 末次给药后1 h进行实验，将胶条粘在大鼠尾端2 cm处，悬挂在高于地面50 cm的架子上，使大鼠呈倒悬体位，每两只大鼠间用挡板隔开。观察6min，用秒表记录后4min的累计悬尾不动时间。不动状态以大鼠停止挣扎，身体呈静止垂直倒悬状态为准。

2.2.4藜欢解郁胶囊对大鼠血液中NE、DA、5-HT及CORT含有量的影响 于末次给药后3 h从大鼠腹主动脉取血6～8 mL，置于试管中，4℃条件下3 000 r/min离心10 min，分离血清，放置-20℃冰箱保存。采用ELISA法测定血清中NE、DA、5-HT、CORT的含有量。

2.2.5藜欢解郁胶囊对大鼠海马BDNF蛋白表达水平的影响 大鼠处死后于冰上取脑，分离双侧海马后置液氮中保存，采用Western b1ot法检测BDNF蛋白含有量变化。

2.2.5.1蛋白浓度测定 从-80℃冰箱取出海马组织（35～52 mg）/组，剪碎放入加有300μL RIPA的1.5 mL VP管，4℃，超声粉碎3～5次，4℃放置1 h，移入离心管，4℃，12 000 r/min，离心10 min。取上清液，稀释一定倍数后考马斯亮蓝法测蛋白浓度。利用下表测定A595值，做出标准曲线，计算出样品的蛋白浓度。样品与考马斯亮蓝溶液 （考马斯亮蓝∶水为1∶4）比例为1∶10。见表1［其中1～8代表不同的加样孔，是标准品 （BSA）梯度稀释后的编号。BSA的原液质量浓度为0.5mg/mL］。

表1　考马斯亮蓝法蛋白质量浓度

2.2.5.2蛋白质免疫印迹分析 ①稀释后的上清液加入等体积2×电泳上样缓冲液，95℃水浴变性5 min，-80℃冻存备用。②80μg组织总蛋白在15%和4%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离至溴酚蓝到达凝胶即止。③将凝胶湿法转印至硝酸纤维素膜 （NC膜）。④取出NC膜，浸于含5%脱脂奶粉的Tris缓冲生理盐水（Tris buffered sa1ine，TBS）中室温轻摇封闭1 h，用含0.05%的吐温20的TBS（TBST）缓冲液漂洗干净，浸入含5%脱脂奶粉的TBST稀释的一抗（兔抗人BDNF抗体1∶500），GAPDH抗体（1∶5 000），4℃孵育过夜。⑤用TBST漂洗NC膜3次（每次8 min），在TBST稀释的HRP标记的二抗溶液（山羊抗兔IgG 1∶4 000）中室温孵浴1 h。⑥NC膜用TBST缓冲液漂洗3次，用ECL检测试剂盒显色（滴加A+B混合液，每张膜约200μL），曝光、显影和定影，胶片经图像分析软件测定灰度值。以GAPDH为内参，用相对值（BDNF/GAPDF）表示各实验组蛋白表达水平。

3　实验结果

3.1药物对大鼠体质量、饮食、毛发、排泄的影响 与空白组比较，模型组动物造模后体质量增长缓慢 （P＜0.01）；与模型组比较，各给药组动物体质量增加明显（P＜0.05，P＜0.01）。造模后模型组动物皮毛出现干枯、起球、脱落现象，身体出现斑秃，且不思饮食，蜷缩在笼子一侧，不喜活动，大便干枯，量少，小便发黄。而给药组情况有明显改善，饮食正常，毛发脱落减少，皮毛较光滑油亮，大小便基本正常，结果见表2。

表2　藜欢解郁胶囊对大鼠体质量的影响 （n=8，±s）

表2　藜欢解郁胶囊对大鼠体质量的影响 （n=8，±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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3.2大鼠强迫游泳实验 造模后，模型组不动时间延长，与空白组进行比较，有显著性差异 （P＜0.05），说明模型组造模成功。与模型组比较，藜欢解郁胶囊低、高剂量组均可明显缩短大鼠强迫游泳不动时间 （P＜0.05，P＜0.01）。与盐酸氟西汀组比较，在给药后无显著性差异（P＞0.05）。这说明藜欢解郁胶囊可显著对抗大鼠因慢性应激性刺激造成的抑郁症状，结果见表3。

表3　藜欢解郁胶囊对强迫游泳大鼠不动时间的影响 （n= 8，±s）

表3　藜欢解郁胶囊对强迫游泳大鼠不动时间的影响 （n= 8，±s）

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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3.3大鼠悬尾实验 造模后，模型组不动时间延长，与空白组有显著性差异 （P＜0.05）；与模型组相比，藜欢解郁胶囊低、高剂量组均可以缩短大鼠不动时间，其中高剂量组可显著性缩短大鼠不动时间 （P＜0.01），可明显改善大鼠因慢性应激性刺激造成的抑郁症状，结果见表4。

表4　藜欢解郁胶囊对悬尾大鼠不动时间的影响 （n=8，±s）

表4　藜欢解郁胶囊对悬尾大鼠不动时间的影响 （n=8，±s）

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.01

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3.4藜欢解郁胶囊对大鼠血液中NE、DA、5-HT及CORT含有量的影响 与空白组比较，模型组能明显降低大鼠血清中NE、DA、5-HT的含有量，升高血清中CORT的含有量 （P＜0.01），说明造模成功。与模型组比较，盐酸氟西汀组及藜欢解郁胶囊组均能明显升高大鼠血清中NE、DA、5-HT的含有量，并且降低血清中CORT的含有量（P＜0.05，P＜0.01），结果见表5。

表5　藜欢解郁胶囊对大鼠血清中NE、DA、5-HT、CORT含有量的影响（n=8，±s）

表5　藜欢解郁胶囊对大鼠血清中NE、DA、5-HT、CORT含有量的影响（n=8，±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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3.5藜欢解郁胶囊对大鼠海马BDNF蛋白表达水平的影响

与空白组比较，模型组能明显降低大鼠海马BDNF蛋白表达 （P＜0.01）。与模型组比较，盐酸氟西汀组和藜欢解郁胶囊组均能明显增强大鼠海马BDNF蛋白表达 （P＜0.01），结果见表6、图1。

4　讨论

表6　藜欢解郁胶囊对大鼠海马BDNF蛋白表达水平的影响（n=4，±s）

表6　藜欢解郁胶囊对大鼠海马BDNF蛋白表达水平的影响（n=4，±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01

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抑郁症的发生与体内神经内分泌系统紊乱有关。环境变化 （如慢性应激等）是诱致体内激素水平变化的主要因素，主要影响脑内边缘系统-下丘脑-垂体-肾上腺素轴的激素水平。抑郁症模型动物的行为改变与内源性抑郁症症状相似，包括活动能力下降、脑内单胺神经递质的变化及下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进引发的高皮质酮血症等［6-7］。中枢单胺类神经递质如NE、DA、5-HT等含有量减少是抑郁症的病理机制之一，有研究人员对重度抑郁症的患者进行尸检，发现患者脑内单胺神经递质的含有量明显低于正常人。因此，提高中枢神经系统单胺类神经递质功能或提高它们在神经突触间隙的浓度的药物都有改善情绪或治疗抑郁症状的作用。

图1　藜欢解郁胶囊对大鼠海马BDNF蛋白的表达

海马是边缘系统的重要组成部分，对情绪、学习和记忆、行为等调节起重要作用，也是应激反应的高位调节中枢。慢性应激可损害海马，引起其结构和功能的变化［5］。BDNF、神经生长因子（NGF）、神经营养因子-3（NT-3）等多种神经营养因子合成的缺乏可能造成海马神经元的损失和凋亡［6-7］。BDNF的缺乏可导致海马发生病理变化从而引起抑郁症，BDNF表达水平的下降参与了抑郁症的某些病理生理过程。当机体处于长期的应激或慢性神经心理应激状态时，机体处于失代偿阶段，经过一系列中间因子的作用，BDNF表达下调，导致神经细胞凋亡或死亡［8-10］。因而有学说认为海马体神经元产生的BDNF缺失和功能降低会构成抑郁行为，抗抑郁药能提高脑的BDNF水平，BDNF通过激活其高亲和力受体TrkB对神经元的生存及活动起重要调节作用［11-12］，BDNF的表达增加有利于神经元的生存，提高海马突触可塑性，是各种抗抑郁剂治疗的共同作用机制。此外，BDNF还与单胺系统密切相关，BDNF对5-HT神经元具有神经保护作用，而BDNF的表达同时也受5-HT调节［13-15］。当处于应激状态时，机体可产生一系列反应来进行调节以便最终适应应激状态，其中包括升高脑内BDNF的表达水平。当应激持续作用于机体时，BDNF水平将持续升高，最终通过进一步发展后将破坏BDNF与5-HT能神经元功能的动态平衡，产生神经性毒性并导致海马神经元的进一步凋亡，进而出现脑内海马BDNF表达持续减少，最终导致脑内BDNF水平下降、5-HT及5-HT能神经元功能的减弱，最终发展成为一种新的病态平衡［16-18］。

本实验结果得知，藜欢解郁低、高剂量组均可改善抑郁大鼠的体质量、饮食、毛发、排泄等情况，明显缩短大鼠强迫游泳不动时间和大鼠悬尾不动时间，显著增加大鼠体内单胺递质NE、DA、5-HT等的含有量，明显降低CORT的含有量，显著增强脑内海马体BDNF蛋白表达水平，提示藜欢解郁胶囊具有抗抑郁作用，其作用机制可能是通过提高单胺类神经递质功能，抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴功能，提高脑内海马BDNF的表达水平，升高5-HT含有量，保护5-HT能神经元功能等途径发挥抗抑郁作用。

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R285.5

B

1001-1528（2016）06-1383-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.038

2015-05-27

上海市科学技术委员会中药现代化项目 （10DZ1971800）；上海市教育委员会预算内项目 （2011JW26）

刘梅 （1978—），女，硕士，副研究员，主要从事中药新药研发及新剂型的研究。Te1：（021）51323105，E-mai1：1mcao@ hotmai1.com

奉建芳 （1966—），男，博士，研究员，主要从事中药新剂型与新制剂的研究。Te1：（021）51323104，E-mai1：fengjianfang @vip.163.com