痹痛消胶囊对大鼠类风湿性关节炎的作用及其机制

陈玉兴， 卓俊城， 黄雪君， 曾晓会， 姚 楠， 黄丹娥， 甘海宁（.广东省中医药工程技术研究院广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州50095；.广州中医药大学，广东广州50405）



痹痛消胶囊对大鼠类风湿性关节炎的作用及其机制

陈玉兴1， 卓俊城2， 黄雪君1， 曾晓会1， 姚 楠1， 黄丹娥1， 甘海宁1
（1.广东省中医药工程技术研究院广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州510095；2.广州中医药大学，广东广州510405）

目的 探讨痹痛消胶囊 （青风藤、土茯苓、骨碎补等）对大鼠类风湿性关节炎的治疗作用及其作用的相关机制。方法 70只SD大鼠除10只作为正常对照组，其余皮下注射Freund's完全佐剂建立类风湿性关节炎大鼠模型，造模成功后分组给药2周，观察给药后痹痛消胶囊高、中、低剂量对类风湿性关节炎大鼠足关节肿胀度、血清超敏C反应蛋白 （hsCRP）、白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）含有量的影响，以及组织病理学观察。结果痹痛消胶囊明显抑制类风湿性关节炎大鼠足关节肿胀度，显著降低类风湿性关节炎大鼠血清中hsCRP、IL-1β和TNF-α的含有量，明显减轻足关节软骨病变程度。结论 痹痛消胶囊具有较好的治疗类风湿性关节炎作用，其作用机制可能与下调其hsCRP、IL-1β、TNF-α的含有量有关。

痹痛消胶囊；大鼠；类风湿性关节炎；血清超敏C反应蛋白 （hsCRP）；白介素-1β（IL-1β）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）；足关节肿胀

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）以慢性、多发性、关节肿痛为主要表现，属自身免疫疾病［1］，我国的 RA患病率大约在0.3%左右［2-3］。RA患者易出现骨质破坏，造成不同程度的关节功能障碍和畸形，最终导致劳动力丧失。RA表现多发、难治、预后差、危害大的特点，针对RA发病机制寻找有效的治疗措施具有重要意义［4］。现阶段西医对于RA的治疗主要应用非甾体类抗炎药、糖皮质激素和一些生物制剂等，临床取得了一定疗效，但亦存在不良反应较多、难以长期应用的不足。许多RA患者转向中医治疗，临床亦取得较好疗效。RA在中医学属 “痹症”范畴，中医中药治疗RA独具自身优势［5］。中医学认为RA本虚标实，内因为阴阳受损、营卫不和、气血亏虚，外因为六淫邪气［6］。痹痛消胶囊根据RA的内因外因经临床多年应用总结形成，组方药味有青风藤、土茯苓、骨碎补、补骨脂、杜仲、当归、三七、泽兰、甘草，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛的功效，对中医临床 “风湿痹痛”有较好的治疗作用，本实验进行了痹痛消胶囊抗大鼠类风湿性关节炎的实验研究，为痹痛消胶囊临床应用提供实验性参考依据。

1　材料与仪器

1.1动物 SD大鼠，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号44007200007843。

1.2药物 痹痛消胶囊由广东省中医研究所制剂室制备提供，批号140312；塞来昔布胶囊 （国药准字J20130063，Pfizer Pharmaceutica1s LLC，口服，0.2 g/粒，批号BK13CCEK079）；痹祺胶囊（国药准字Z10910026，天津达仁堂京万红药业有限公司，0.3 g/粒，批号301908）。

1.3试剂 Freund's Adjuvant Comp1ete（美国Sigma-A1drich公司，批号Lot#SLBH7316V）；ELISA Kit for Rat hsCRP、ELISA Kit for Rat IL-1β（上海西唐生物科技有限公司，批号1311251、1309261）；ELISA Kit for Rat TNF-α（上海博谷生物科技有限公司，批号20130103）；甲醛 （广州化学试剂厂，批号20130409-1）；无水乙醇 （天津威晨化学试剂科贸有限公司，批号20130318）。

1.4仪器 JJ3000动物电子秤 （常熟市双杰测试仪器厂）；BS224S电子天平 （德国Sartorius）；HH-6数显恒温水浴锅 （金坛市富华仪器有限公司）；3K30离心机（德国Sigma公司）；YLS-7A足趾容积测量仪 （山东医学科学院设备站）；Bio-RAD 680酶标仪（美国Bio-Rad公司）；病理组织学切片全套设备；O1ympus DP2-BSW病理图像采集系统（日本O1ympus公司）。

2　方法

2.1模型制备 取SD大鼠70只，随机留取10只作为正常对照组，其余60只大鼠作为类风湿性关节炎模型组。造模型前，各大鼠用YLS-7A足趾容积测量仪测定造模前大鼠右后足跖正常体积。测量

后，模型组60只大鼠均右后足趾处皮下注射Freund's完全佐剂0.15 mL诱导RA大鼠模型，正常对照组10只大鼠同法皮下注射生理盐水0.15 mL。造模后第10天，各大鼠同上法进行右后足跖体积测量，计算造模10 d给药前足跖肿胀度 （造模10 d给药前足跖肿胀度=造模10 d右后跖体积-造模前右后足跖正常体积）。

2.2分组给药 造模成功后，60只模型大鼠按足跖肿胀度分为6组，分别为模型对照组，塞来昔布胶囊组（36 mg/kg），痹祺胶囊组（0.324 g/kg），痹痛消胶囊高 （0.972 g/kg）、中 （0.486 g/kg）、低 （0.243 g/kg）剂量组。各给药组按剂量灌胃给药，正常对照组、模型对照组给予等体积蒸馏水，每日1次，连续14 d。

2.3检测指标 末次给药后1 h，各组大鼠同上法进行右后足跖体积测量，计算给药后足跖肿胀度（给药后足跖肿胀度=给药后右后足跖体积-造模前右后足跖正常体积）。测量后取血，放置，离心，取上清液，按试剂盒说明书介绍的方法检测hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量。关节组织病理学检测：取右后足跖处关节部位，大体观察后常规固定、脱钙、包埋、封片、染色，光镜观察关节病变，包括滑膜组织增生、软骨下骨质破坏和血管翳的形成。病理损伤评分分为5级［7-8］：0分为正常；1分为轻微局部炎性细胞浸润；2分为中度炎性细胞浸润；3分为重度炎性细胞浸润，无软骨损伤、血管翳形成；4分为重度炎性细胞浸润并伴有血管翳形成和 （或）软骨、骨质破坏。

2.4统计学处理 SPSS 15.0软件统计，数据采用均数加减标准差 （±s）表示，单因素方差分析（one-way ANOVA）结果。

3　结果

3.1痹痛消胶囊对类风湿性关节炎大鼠足跖肿胀度的影响 造模10 d给药前，与正常对照组比较，模型对照组，塞来昔布胶囊组，痹祺胶囊组，痹痛消胶囊高、中、低剂量组大鼠造模后足跖肿胀度均显著增大 （P＜0.01），模型对照组，塞来昔布胶囊组，痹祺胶囊组，痹痛消胶囊高、中、低剂量组之间两两比较，大鼠造模后足跖肿胀度均无明显差异 （P＞0.05）。给药14 d后，与正常对照组比较，模型对照组大鼠足跖肿胀度显著增大 （P＜0.01）；与模型对照组比较，痹痛消胶囊高、中、低剂量组大鼠足跖肿胀度明显减小 （P＜0.01）。见表1。

表1　痹痛消胶囊对类风湿性关节炎大鼠足跖肿胀度的影响 （n=10，±s）Tab.1 Effects of Bitongxiao Capsu les on paw swelling of ratswith rheumatoid arthritis（n=10，±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，##P＜0.01

组别　　　剂量/（g·kg-1）　　　造模10 d给药前足跖肿胀度/mL　　　给药后足跖肿胀度/m L正常对照组　　　—0.003±0.013　　0.004±0.017模型对照组　　　—　　0.563±0.064**　　0.687±0.107**塞来昔布胶囊组　　0.036　　0.543±0.071**　　0.456±0.072##痹祺胶囊组　　0.324　　0.563±0.104**　　0.497±0.106##痹痛消胶囊高剂量组　　0.972　　0.544±0.075**　　0.405±0.072##痹痛消胶囊中剂量组　　0.486　　0.564±0.095**　　0.397±0.072##痹痛消胶囊低剂量组　　0.243　　0.585±0.102**　　0.476±0.092##

3.2痹痛消胶囊对类风湿性关节炎大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量均显著增加 （P＜0.01）。与模型对照组比较，痹痛消胶囊高、中、低剂量组大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量均明显减小（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2　痹痛消胶囊对类风湿性关节炎大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量的影响（n=10，±s）Tab.2 Effects of Bitongxiao Capsules on hsCRP，IL-1β，TNF-αcontents of rats w ith rheumatoid arthritis（n=10，±s）

表2　痹痛消胶囊对类风湿性关节炎大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量的影响（n=10，±s）Tab.2 Effects of Bitongxiao Capsules on hsCRP，IL-1β，TNF-αcontents of rats w ith rheumatoid arthritis（n=10，±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别　　　剂量/（g·kg-1）　　hsCRP/（ng·mL-1）　　IL-1β/（pg·m L-1）　　TNF-α/（pg·m L-1）正常对照组　　　—46.562±7.692　　268.906±129.140　　102.792±11.948模型对照组　　　—　　93.749±4.573**　　608.438±79.416**　　228.792±31.106**塞来昔布胶囊组　　0.036　　67.282±4.867##　　413.125±103.238##　　141.750±24.200##痹祺胶囊组　　0.324　　74.196±1.819##　　478.438±93.808#　　155.542±13.770##痹痛消胶囊高剂量组　　0.972　　64.540±4.872##　　393.906±125.133##　　138.375±18.571##痹痛消胶囊中剂量组　　0.486　　68.458±5.340##　　432.031±149.224##　　142.167±22.322##痹痛消胶囊低剂量组　　0.243　　71.277±3.394##　　474.531±93.921#　　153.542±9.564##

3.3痹痛消胶囊对类风湿性关节炎大鼠关节组织病理学的影响 关节组织病理学评分：与正常对照组比较，模型对照组大鼠关节组织病理学评分显著增大 （P＜0.01）。与模型对照组比较，痹痛消胶囊高、中、低剂量组大鼠关节组织病理学评分均明显减小 （P＜0.01）。见表3。

表3　痹痛消胶囊对类风湿性关节炎大鼠关节组织病理学评分的影响（n=10，±s）Tab.3 Effects of Bitongxiao Capsules on histopathological score of rats joint w ith rheumatoid arthritis（n= 10，±s）

表3　痹痛消胶囊对类风湿性关节炎大鼠关节组织病理学评分的影响（n=10，±s）Tab.3 Effects of Bitongxiao Capsules on histopathological score of rats joint w ith rheumatoid arthritis（n= 10，±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，##P＜0.01

组别　　　剂量/（g·kg-1）关节组织病理学评分/分正常对照组　　　—0.000±0.000模型对照组　　　—　　3.200±0.632**塞来昔布胶囊组　　0.036　　1.400±0.516##痹祺胶囊组　　0.324　　2.300±0.675##痹痛消胶囊高剂量组　　0.972　　1.700±0.483##痹痛消胶囊中剂量组　　0.486　　1.700±0.675##痹痛消胶囊低剂量组　　0.243　　2.200±0.632##

关节组织病理学照片：正常对照组大鼠关节处未出现病理改变，软骨结构完整，软骨表面光滑。模型对照组大鼠关节出现病理改变，表现为软骨表面局部粗糙不平，缺失形成溃疡，软骨基质水肿，见轻度增生和炎细胞浸润。痹痛消胶囊组和塞来昔布胶组、痹祺胶囊组在病变范围和病变严重程度方面与模型组比较均有降低或减轻，组织水肿、变性、簇聚和坏死方面均轻于模型组。见图1。

4　讨论

中医学认为RA病因是正气不足、外感寒湿，治疗应当固本培元、活血通络、清热解毒、消肿止痛，通过综合治疗整体调节达到促进患者康复的目的［9］。

RA活动期可见关节局部红肿、灼热疼痛，关节周围组织水肿，炎症，局部压痛，可有关节积液、活动受限或不能活动等；控制活动期发展是治疗的关键［10］。本次实验研究的药物痹痛消胶囊是根据RA的内因、外因经临床多年应用总结形成，方中青风藤祛风湿、通经络，土茯苓除湿解毒、通利关节，为君；骨碎补强骨止痛、补骨脂温肾固本、杜仲补肾强筋，为臣；当归活血止痛、三七散瘀定痛、泽兰化瘀消肿，为佐；甘草调和诸药。诸药合用，共奏祛风除湿、活血通络、消肿止痛之功。临床主要用于RA急性活动期取得较好疗效。实验结果表明痹痛消胶囊能显著减轻类风湿性关节炎大鼠的足跖肿胀度，与临床处方多年应用结果基本一致。

图1　痹痛消胶囊对类风湿性关节炎大鼠关节组织病理学的影响 （HE，×200）Fig.1 Effects of Bitongxiao Capsules on joint tissue pathology of rats w ith rheumatoid arthritis（HE，× 200）

RA活动期CRP血清含有量显著升高，在疾病的鉴别诊断和预后判断方面均有一定的价值［11］。本实验表明痹痛消胶囊明显降低了类风湿性关节炎大鼠血清hsCRP含有量，提示痹痛消胶囊可较好改善类风湿性关节炎的预后情况。

在类风湿性关节炎患者中IL-1β含有量明显升高，IL-1β参与炎症、免疫反应，在形成RA的炎症、黏附、新生血管生成过程中起着重要作用［12］。IL-1β可刺激滑液和软骨细胞合成并释放前列腺素E2（PGE2）和胶原酶，引起滑膜炎症反应、软骨基质崩解［13］，引起关节软骨的破坏。另外，IL-1β还可以作用于内皮细胞，促进嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的聚集，加重关节局部炎症反应［14］。因此，抑制IL-1β对减轻炎症反应、改善RA患者症状有重要意义。本实验结果证明痹痛消胶囊能显著降低RA大鼠血清中IL-1β含有量，提示痹痛消胶囊可能通过减少促炎细胞因子的产生从而减轻RA大鼠足肿胀炎症反应来发挥抗RA的作用。

TNF-α是启动炎症反应的关键细胞因子。TNF-α通过刺激血管内皮细胞表达黏附分子，刺激单核-吞噬细胞和其他细胞分泌趋化性细胞因子，引起白细胞在炎症部位聚集［15］。我们实验结果说明痹痛消胶囊能明显减少RA大鼠血清中TNF-α含有量，表明这是其治疗类风湿性关节炎有效途径之一。

组织病理学观察表明，痹痛消胶囊能明显减轻关节出现的病理学改变，减少炎细胞浸润，有利于改善RA患者的生活质量。

本项实验初步研究了痹痛消胶囊抗类风湿性关节炎的作用，结果令人期待，值得进一步开发应用。

［1］龙小琴，马武开.中医药治疗类风湿关节炎的研究进展［J］.世界中西医结合杂志，2012，7（10）：912-914.

［2］Firestein G S.Evo1ving concepts of rheumatoid arthritis［J］. Nature，2003，423（6937）：356-361.

［3］李振彬.中药有效成分及其配伍治疗类风湿关节炎的研究进展［J］.解放军医药杂志，2012，24（10）：1-4.

［4］李君丽，孙 蕾，席忠新，等.中药单体成分治疗类风湿关节炎研究进展［J］.中药材，2012，35（8）：1355-1360.

［5］张嘉倩，刘淑清.中医扶正法治疗类风湿关节炎的研究进展［J］.中医药导报，2012，18（9）：102-104.

［6］彭江云，狄朋桃，方春凤，等.类风湿关节炎中医发病学初探［J］.世界中西医结合杂志，2012，7（10）：857-860.

［7］王威严，杨清锐，师健民，等.伯氏疏螺旋体诱导大鼠类风湿关节炎模型的建立［J］.山东大学学报：医学版，2015，53（9）：47-52.

［8］Hegemann N，Wondimu A，U11rich K，etal.Synovia1MMP-3 and TIMP-1 1eve1s and their corre1ation with cytokine expression in canine rheumatoid arthritis［J］.Vet Immunol Immunopathol，2003，91（3-4）：199-204.

［9］马艳苗，王永辉，李艳彦，等.风湿宁胶囊的主要药效学研究［J］.世界中西医结合杂志，2012，7（9）：806-809.

［10］王守志.草皮清痹洗剂改善类风湿关节炎急性活动期局部症状疗效观察［J］.中国中医急症，2012，21（7）：1187-1188.

［11］王丽琴，王 钢，王 佳，等.联合检测多项指标在类风湿关节炎诊断中的应用进展［J］.中华中医药学刊，2012，30（10）：2237-2239.

［12］黄明进，罗春丽，郭 刚，等.黑骨藤抗类风湿性关节炎作用及其分子机制［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（12）：174-177.

［13］Fumiaki K，Hiroaki N，Yasuharu S，et al.Prostag1andin E2is an enhancer of inter1eukin-1β-induced expression ofmembraneassociated prostag1andin E synthase in rheumatoid synovia1fibrob1asts［J］.Arthritis Rheum，2003，48（10）：2819-2828.

［14］Jae-Gyun J，Jong-Mook K，Hongchan C，et al.Effects of IL-1βon gene expression in human rheumatoid synovia1 fibrob1asts［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，324（1）：3-7.

［15］王晓玉，张晓兰，张 丽，等.四妙丸对大鼠佐剂性关节炎作用机制的研究［J］.中国中药杂志，2010，35（21）：2889-2892.

Effect of Bitongxiao Capsules against rheum atoid arthritis and itsmechanism

CHEN Yu-xing1， ZUO Jun-cheng2， HUANG Xue-jun1， ZENG Xiao-hui1， YAO Nang1， HUANG Dan-e1， GAN Hai-ning1

（1.Guangdong Provincial Engineering Technology Research Institute of T.C.M，Guangzhou 510095，China；2.Guangzhou Universisty of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

AIM To observe the therapeutic effectof Bitongxiao Capsu1es（BTX）（SinomeniiCaulis，Smilacis glabrae Rhizoma，Drynariae Rhizoma，etc.）against rheumatoid arthritis（RA）and its mechanism of action. M ETHODS Seventy SD rats，except for ten rats as the contro1 group，the rest received SC Freund′s comp1ete adjuvant tomake the RA ratmode1.After two weeks，mode1 rats were administered BTX high，medium and 1ow dose.The anti-arthritic effects against RA were studied through observing the changes ofpaw swe11ing，high-sensitivity C-reactive protein（hsCRP），inter1eukin 1β（IL-1β），and tumor necrosis factorα（TNF-α）aftermedication.RESULTS BTX cou1d significant1y inhibit RA rats paw swe11ing，decrease the 1eve1s of hsCRP，IL-1β，and TNF-αin the serum of RA rats.CONCLUSION BTX has better therapeutic effect on RA and itsmechanism may be re1ated to the down-regu1ation of hsCRP，IL-1β，and TNF-α.

Bitongxiao Capsu1es（BTX）；rat；rheumatoid arthritis；C-reactive protein（hsCRP）；inter1eukin 1β（IL-1β）；tumor necrosis factorα（TNF-α）；paw swe11ing

R285.5

A

1001-1528（2016）06-1211-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.002

2015-08-31

广东省科技计划项目 （2011B032200016）

陈玉兴 （1971—），男，主任中药师，主要从事中药药理研究工作。Te1：（020）83576735，E-mai1：cyx89333@qq.com