遗传性代谢病高危患儿尿有机酸的筛查①

曾凡勇，吴卫红，刘建军，张雁，李南玲，席冰玉

·临床研究·

遗传性代谢病高危患儿尿有机酸的筛查①

曾凡勇，吴卫红，刘建军，张雁，李南玲，席冰玉

目的探讨气相色谱质谱技术（GC/MS）在遗传性代谢病高危患儿筛查中的应用。方法2010年3月～2015年11月，疑有遗传性代谢病患儿119例，采用GC/MS检测尿液中有机酸的含量，对相关疾病进行筛查。结果阳性17例（14.29%），可疑阳性20例（16.81%）。阳性患儿主要表现为发育落后16例（94.12%）。结论GC/MS是筛查遗传性代谢病高危患儿病因的一种有效措施，可为进一步明确诊断提供筛查依据。

遗传性代谢病；气相色谱质谱；有机酸；筛查

［本文著录格式］曾凡勇，吴卫红，刘建军，等.遗传性代谢病高危患儿尿有机酸的筛查［J］.中国康复理论与实践，2016，22（8）：947-951.

CITED AS：Zeng FY，Wu WH，Liu JJ，et al.Screening of urinary organic acid in children with high risk of inherited metabolic diseases［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（8）：947-951.

遗传性代谢病（inherited metabolic disease，IMD）又称先天性代谢缺陷（inborn errors of metabolism，IEM），由英国医生Garrod在1902年首先提出。它是单基因突变导致维持机体正常代谢所必需的某种酶、运载蛋白、膜或受体等的编码基因发生突变，从而导致机体生化代谢紊乱，造成中间、旁路代谢产物蓄积，或终末代谢产物缺乏，引起一系列临床症状的一组疾病［1］。

先天性遗传代谢病病因及临床表现复杂，常常导致严重神经系统损害，临床表现具有非特异性，诊断完全依赖特殊实验室检查，包括代谢产物分析、酶学或蛋白组学分析和基因分析。对代谢产物进行检测分析是筛查、诊断和鉴别诊断代谢缺陷病的主要方法，也是酶学或基因分析的前提和基础。气相色谱质谱技术（gas chromatography mass spectrometry，GC/MS）是目前常用的检测代谢产物的方法之一。GC/MS是由色谱分析技术和质谱分析技术组成，利用气相色谱仪的分离能力让混合物中的组分分离，并用质谱仪鉴定分离出来的组分（定性分析），计算出精确的量（定量分析）。

1　对象和方法

1.1对象

2010年3月～2015年11月，到本科门诊就诊或住院康复，疑有遗传性代谢病患儿119例，其中男性70例，女性49例；来诊时年龄最小58 d，最大9岁9个月，平均（1.97±1.68）岁。

2　筛查结果

2.1阳性

筛查阳性的患儿可以是其中一项指标异常，也可以是2项或多项指标异常，如某一患儿多项指标异常，统计时按1例患儿计算。共17例患儿筛查结果为阳性，阳性率为14.29%。

甲基丙二酸尿症7例，其中4例检出的甲基丙二酸数值分别为6.53 μmol/L、0.95 μmol/L、6.67 μmol/ L、1.07 μmol/L，另3例少量甲基丙二酸检出。戊二酸尿症2例，检出3-羟基丙酸。生物素缺乏或多种羧化酶缺乏症5例，检出巴豆酰甘氨酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸。线粒体脂肪酸代谢障碍5例，其中3例并发其他代谢障碍。非酮症性二羟基尿症3例，其中2例并发他代谢障碍。

这17例患儿中，1例为甲基丙二酸尿症并发线粒体脂肪酸代谢障碍；1例为甲基丙二酸尿症、非酮症性二羧基酸尿症并发线粒体脂肪酸代谢障碍；1例为生物素缺乏或多羧化酶缺乏症、非酮症性二羧基酸尿症并发线粒体脂肪酸代谢障碍。

2.2可疑阳性

可疑阳性主要指某些指标超出正常值范围，但仅凭这些指标无法明确诊断，需要依据其他检测方法进一步确定。共20例，可疑阳性率16.81%，其中包括酮症、营养障碍17例，维生素B族缺乏3例。

2.3阳性患儿主要临床表现

其中发育落后占16例（94.12%），孕期保胎、感染史占4例（23.53%），生时窒息3例（17.65%），双胎、早产、低体质量占4例（23.53%），有异常家族史占3例（17.65%），肌张力高、病理征阳性4例（23.52%）；脑电图或头部MRI异常者5例（29.41%）。见表2。

表1　筛查阳性患儿主要异常指标（μmol/L）

表2　筛查阳性患儿临床表现（n）

3　讨论

遗传性代谢病单一病种发病率低，属少见病，但病种多样，迄今已发现的遗传性代谢病超过1000种。近年来随着生物化学、分子遗传学和计算机科学的迅速发展，遗传性代谢病的诊断和治疗在我国逐步引起重视［2-3］。我国台湾地区2000年～2009年筛查新生儿1，495，132例，确诊遗传性代谢病170例，总体发病率为1∶6219；其中氨基酸代谢异常107例，有机酸代谢异常51例及脂肪酸代谢异常12例［4］。遗传性代谢病常引起多器官功能损害，最常累及中枢神经系统，可导致智力及运动功能障碍，甚至残疾，部分疾病治疗费用昂贵，给家庭和社会带来沉重的精神及经济负担。目前，北美、欧洲、日本和新加坡等国家已普遍将GC/MS技术应用于小儿遗传性代谢病筛查方案中［5］。

在临床工作中，碰到原因不明的智力低下/发育落后、顽固性惊厥、肌张力异常、持续或反复黄疸/肝功能损害、肝脾肿大、反复呕吐/腹泻/喂养困难的患儿，尤其并发以下情况时，应及时进行遗传性代谢病高危筛查，防止误诊误治。①阳性家族史；②实验室检查异常如反复或持续低血糖、严重代谢性酸中毒、高血氨、头部影像学改变等；③经常规抗癫痫、护肝等治疗后病情无好转。早期诊断对于一些可给予特殊饮食及药物干预的疾病（如苯丙酮尿症、甲基丙二酸血症并发同型半胱氨酸血症等）的预后有重要意义［6-7］。

因临床症状体征缺乏特异性，遗传性代谢病的诊断主要依赖实验室检查。由于尿液中含有氨基酸、糖类、有机酸、醇类等代谢终产物，其浓度高于血清，易于收集，而且大部分代谢产物易挥发，故可以通过GC/MS检测尿液的特征性代谢产物，为诊断遗传性代谢病提供依据［8］。常见的特征性代谢产物［8-10］见表3。

由于采样时期、患者个体的差异，相同疾病患者尿液GC/MS代谢产物谱图会不同，特别在疾病发作的间歇期，尿液代谢产物谱图常未见异常，故采用患者急性期样本或进行多次检测，可提高疾病的检出率。临床上最常用的筛查、确诊遗传性代谢病的手段主要是GC/MS法和串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）法［11-12］。其中GC/MS对于有机酸尿症的诊断最敏感［13］。随着尿素酶前处理技术的成熟和普及，由于尿中各种代谢产物没有被提取，GC/MS检测不仅局限于有机酸尿症，还能诊断氨基酸代谢异常等［14］。故尿液GC/MS技术是筛查和诊断有机酸尿症及氨基酸代谢异常的重要方法。

GC/MS、MS/MS、酶活性测定、基因检测等方法互为补充。如对于高苯丙氨酸血症患者，除了GC/ MS、MS/MS检测外，应进行尿液喋呤谱分析、四氢生物喋呤负荷试验，鉴别是否为四氢生物喋呤反应性高苯丙氨酸血症，根据疾病类型进行相应的基因诊断；尿液中甲基丙二酸显著增高可以诊断为甲基丙二酸尿症（methylmalonic aciduria，MMA），通过血清或尿液总同型半胱氨酸测定鉴别单独型MMA或MMA并发同型半胱氨酸血症。同时，一些指标异常也可能与多种疾病有关，需要进一步鉴别诊断。如血液中丙酰肉碱增高可以发生在MMA、生物素酶缺乏患者，也可能发生在脑叶酸缺乏症及维生素B12、叶酸、生物素缺乏的患者。戊二酸尿症Ⅱ型、极长链酯酰辅酶A脱氢酶缺乏症、高氨血症Ⅱ型等患者可呈间歇性异常，在发热、饥饿、疲劳、饮食不当、某些药物刺激下出现代谢紊乱。因此，应重视间歇性异常、急性代谢紊乱、急性脑病、肝病、猝死样发作患者的代谢病筛查。GC/MS只能确诊有限的遗传代谢性疾病，需要结合几种方法来综合判断，为患者提供更准确的诊断并指导治疗。遗传性代谢病诊断流程见图1［15］。

表3　遗传代谢性疾病的常见特征性代谢产物

图1　遗传性代谢病诊断流程

此次筛查分析的阳性率为14.29%，可疑阳性率为16.81%。可疑阳性率较高的原因可能如下。首先，GC/MS法筛查可疑阳性者不能即认为是遗传性代谢病，只是提示先天性代谢异常可能，这些异常需要在进一步的特异性检查后确诊或排除。其次，已经表现为发育落后的患儿其先天性代谢异常的发病率远高于目前表现为正常的患儿。同时，与本次分析的样本量较小有关。

17例筛查阳性的患儿从病例特点来看，绝大多数临床上表现为发育落后（94.12%），只有4例有孕期保胎、感染史（23.53%），3例生时窒息（17.65%），4例为双胎、早产、低体重（23.53%），3例有家族史（17.65%），5例EEG或MRI异常（29.41%），比例均低于30%。需要注意的是，有4例临床上疑似为“脑性瘫痪”，临床查体发现肌张力高、病理征阳性的患儿，进行代谢筛查后有阳性发现。故对于以发育落后为主要表现，康复训练效果欠佳，临床症状有波动的疑似遗传代谢性疾病的患儿，需要高度警惕遗传性代谢病的可能。

我们需要进一步做的是：①将可疑阳性的病例根据不同筛查结果，选择血氨基酸谱、酰基肉碱分析，血糖、血电解质、血氨、乳酸、丙酮酸、基因分析等，根据病情选择性进行组织活检和影像学检查，脑电图、超声心动图、裂隙灯等特殊检查，进一步明确诊断；②与检测机构合作，在大样本量的检测基础上，制定不同年龄段各项指标的正常值范围，为临床诊断和鉴别诊断提供更加可靠的依据；③也可以将此筛查项目扩展到新生儿的常规筛查，对于许多遗传性代谢病的早期发现、早期诊断和早期治疗，有重要的指导作用。

对于明确诊断的遗传性代谢病，治疗的主要措施包括控制代谢产物蓄积（限制饮食摄入、控制内源性毒性底物产生、加速毒性产物清除），替代终末代谢产物（反应产物替代、基因产物替代），辅助因子替代（维生素、生物素、叶酸、辅酶Q），基因转移（器官移植、单基因转移）和及时正确的支持对症处理（补充液体、纠正酸碱平衡和电解质紊乱）等［16-17］。如MMA患者主要通过维生素B12进行实验性治疗，如果患者对维生素B12治疗有效，则为甲基丙二酰辅酶A变位酶（methylmalonyl coenzyme amutase，MCM）辅酶缺陷型，通过补充维生素B12，改善酶功能进行治疗；而维生素B12治疗无效的，则需严格减少支链氨基酸的摄入，高热量低蛋白饮食，体内甲基丙二酸升高者需服用左卡尼汀帮助机体排出毒性有机酸［18］。经过针对性治疗，许多疾病可以得到有效控制，并辅以适当的康复训练，以减少患儿肢体、智力、语言的功能障碍。

因此，疑有遗传性代谢病的患儿进行相关的尿液筛查，对于明确诊断，选择下一步治疗方案有积极的作用。同时也是开展遗传咨询和系谱分析，进行产前诊断、携带者检出、基因分析、遗传病分子机制研究的基础，对于提高人口素质、降低出生缺陷等具有重要意义。

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Screening of Urinary OrganicAcid in Children with High Risk of Inherited Metabolic Diseases

ZENG Fan-yong，WU Wei-hong，LIU Jian-jun，ZHANG Yan，LI Nan-ling，XI Bing-yu
1.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine，Beijing 100068，China；2.Beijing Bo'ai Hospital，China Rehabilitation Research Centre，Beijing 100068，China

Correspondence to ZENG Fan-yong.E-mail：zengfyzeng@sina.com

Objective To explore the application of gas chromatography mass spectrometry（GC/MS）in children with high risk of inherited metabolic disease.Methods From March，2010 to November，2015，119 children suspected with inherited metabolic disease were included.The urinary organic acid was detected with GC/MS，and related diseases were screened.Results Seventeen children（14.29%）were positive with inherited metabolic disease，in which 16 cases（94.12%）manifested with development retardation.20 children（16.81%）were probable positive.Conclusion GC/MS is effective in screening children with high risk of inherited metabolic disease，which can provide basis for further diagnosis.

inherited metabolic disease；gas chromatography mass spectrometry；organic acid；screening

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.08.014

R722.11

A

1006-9771（2016）08-0947-05

1.首都医科大学康复医学院，北京市100068；2.中国康复研究中心北京博爱医院，北京市100068。作者简介：曾凡勇（1976-），女，汉族，四川隆昌县人，硕士，主治医师，主要研究方向：儿童康复。E-mail：zengfyzeng@sina.com

纳入标准：①不明原因智力低下、发育落后；②难以控制的惊厥发作；③不明原因肝脾肿大/肝功能损害、反复呕吐/腹泻/喂养困难等；④不明原因的代谢紊乱，如低血糖、高氨血症、代谢性酸中毒、酮症等；⑤常与进食蛋白质相关的严重呕吐；⑥尿液、汗液有特殊气味；⑦容貌怪异、皮肤和毛发颜色异常、脱发、顽固皮疹等。

排除标准：已明确诊断为脑性瘫痪、染色体病、脑外伤恢复期、病毒性/细菌性脑炎、格林-巴利综合征恢复期、脊髓性肌萎缩症等疾病所致运动、智力、语言等功能障碍。

对符合标准的患儿进行尿液GC/MS检查。

1.2标本采集

留取晨起空腹尿液8～10 ml（1周内未使用任何药物），如患儿年龄小无法留取晨尿，也可以留取随机尿。尿样均放置在冰箱-18℃冷冻，冰盒保存送检。样本送至北京福佑龙惠（遗传）专科门诊部（Similan Labs），应用气质联用仪GCMS-QP2010Plus（日本岛津公司）上样检查，该仪器可筛查尿有机酸化合物共133种。

1.2.1样品处理

试剂和材料：双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS）、托品酸、17烷酸、24烷酸、尿素酶：美国Sigma Aldrich公司。盐酸羟铵、氢氧化钠、盐酸、无水硫酸钠、乙酸乙酯：北京国药公司。

取尿液5 ml，测定肌酐浓度。取相当于含0.2 mg肌酐的尿样，依次加入尿素酶、盐酸羟铵、氢氧化钠、盐酸，除去蛋白质，进行α-酮酸的腭化处理，并加入托品酸、17烷酸、24烷酸作为内标。用乙酸乙酯两次萃取，分取有机溶剂相，加无水硫酸钠去除残余水分，用高纯氮气吹干后，加入双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷混合物进行甲基硅烷化衍生，80℃温育后移至GC/MS进行分析。

1.2.2仪器设置

色谱柱DB-5 30 m×0.25 mm×1.00 μm；柱温100℃；进样口温度280℃；分流比20∶1；柱流量1.00 ml/min；温度程序100℃（4 min）-4℃/min-280℃（10 min）；进样量1 μl；离子源温度200℃；接口温度280℃；采集模式SCAN；扫描时间6～53 min；扫描范围m/z 50～m/z 500。

1.3统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件对检测结果进行分析，对于阳性病例的检测异常指标采用单样本t检验。显著性水平α=0.05。

（2016-02-02

2016-04-14）