督脉电针对不同时间段脊髓损伤大鼠运动功能及p75神经营养素受体表达的影响①

吕威，莫雨平，李冰，姚海江，景泉凯，宋良玉，王鑫，毛颖秋，李志刚，时素华

·专题·

督脉电针对不同时间段脊髓损伤大鼠运动功能及p75神经营养素受体表达的影响①

吕威1a，莫雨平2，李冰1b，姚海江3，4，景泉凯1a，宋良玉1a，王鑫1a，毛颖秋1c，李志刚1a，时素华5

目的观察督脉电针对脊髓损伤大鼠不同时间段运动功能及p75神经营养素受体（p75NTR）表达的影响。方法雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠180只，随机分为术后1 d、3 d、7 d组，每个时间段组再随机分为空白组、空白电针组、假手术组、模型组和督脉电针组，每组12只。采用改良Allen打击法复制脊髓损伤模型。空白电针组、督脉电针组选取大椎、命门进行电针干预。采用BBB评分法评估大鼠后肢运动神经功能的变化；采用Western blotting法检测p75NTR的表达情况。结果BBB评分结果显示，模型组、督脉电针组评分均低于其他三组；术后7 d，督脉电针组评分显著高于模型组（t=-4.510，P＜0.001）。督脉电针组各时间点p75NTR表达明显低于模型组（P＜0.01）。结论脊髓损伤后受损脊髓组织中p75NTR蛋白表达升高；督脉电针可以提高脊髓损伤大鼠的运动功能，下调受损脊髓组织中p75NTR的表达。

脊髓损伤；督脉；电针；p75神经营养素受体；凋亡；大鼠

［本文著录格式］吕威，莫雨平，李冰，等.督脉电针对不同时间段脊髓损伤大鼠运动功能及p75神经营养素受体表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（8）：876-883.

CITED AS：Lü W，Mo YP，Li B，et al.Effects of Governor Vessel electroacupuncture in different time points on motor functions and p75 neurotrophin receptor after spinal cord injury［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（8）：876-883.

脊髓损伤（spinal cord injury）是由于多种因素导致脊髓的结构改变，出现脊髓休克、运动功能丧失、感觉障碍等一系列功能障碍，严重影响患者身心健康的一种中枢神经系统疾病。临床研究发现，电针疗法能明显减轻和延缓脊髓损伤后的早期病理损害［1-3］；改善局部脊髓组织的微循环，减轻组织间、神经纤维间的水肿；防止继发性损伤；促进脊髓损伤的恢复，对于脊髓损伤的疗效确切［4-11］。p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）是神经生长因子受体/肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族中的一员，是介导细胞凋亡过程中重要的递质［12］，p75NTR与其配体结合后，激活Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinases，JNK）信号级联反应，具有诱导神经细胞凋亡的作用，这个过程在很大程度上阻碍了脊髓损伤的恢复。相关实验研究发现，针灸对于机体能发挥多系统、多层次、多水平、多途径、多靶点的调节作用，电针可以通过抑制脊髓损伤处神经细胞凋亡［13-17］，激活受损神经细胞，使上、下运动神经的功能恢复，使残存生理功能的脊髓神经发挥修复潜力，促使机体重建部分功能，为脊髓损伤功能的修复奠定一定基础。

本研究观察督脉电针对于脊髓损伤后不同时间窗修复过程中行为学、病理形态学以及p75NTR蛋白表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物

清洁级Sprague-Dawley大鼠180只，雄性，体质量（220±20）g，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，合格证号SCXK（京）2011-0004。中国中医科学院中药研究所清洁级动物房饲养，温度为（25±3）℃，湿度（45±10）%，自由饮水进食，12 h昼夜规律调整。适应性饲养3 d后进入实验。

1.2主要试剂和仪器

水合氯醛（分析纯）、苏木素：国药集团化学试剂有限公司。碘伏消毒剂：北京联昌卫生消毒用品有限公司。75%消毒酒精：邯郸市捷利康商贸有限公司。Biotech多聚甲醛：GENE-BIO。二甲苯（分析纯）、无水乙醇（分析纯）：北京化学试剂公司。Solarbio尼氏染色试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。p75NTR抗体、P-C-Jun抗体：美国ABCAM公司。蛋白质分子量Marker：美国THERMO。Haopoly-HRP鼠兔通用二抗试剂盒：上海杰浩生物技术有限公司。感光胶片：美国柯达。

Allen打击装置：北京协和医学院微循环研究所。CP-8000科德士宠物用电推剪：深圳市科德士电器有限公司。中研太和一次性使用无菌针灸针（直径0.30 mm，长25 mm）：无锡佳健医疗器械有限公司。HANS-LH202型韩氏穴位神经刺激仪：北京华卫产业开发公司。RM2235组织切片机：德国LEICA公司。BX53自动化智能型正置研究级显微镜：日本OLYMPUS公司。微量加样器：德国EPPENDORF。电子天平：德国SARTOURIS。4℃低温高速离心机：美国THERMO。半干转电转印仪、稳压稳流电泳仪、垂直电泳槽：美国BIO-RAD。紫外分光光度计：德国BIOPHOTOMETER。

1.3方法

1.3.1动物分组

将大鼠编号，按随机数字表法分为术后1 d组、术后3 d组和术后7 d组。每个时间段组再随机分为5个亚组：空白组、空白电针组、假手术组、模型组、督脉电针组，每个亚组12只。

1.3.2模型制备

大鼠术前禁食禁水8 h，紫外灯消毒动物手术室30 min，手术器械消毒30 min，手术室温度不低于20℃。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于自制的弓形手术台上，备皮脱毛，碘伏消毒后，先定位T8，然后向下依次定位T9-11。取后正中切口，用手术刀片分离背部肌肉，暴露棘突及胸椎旁的肌肉，谨慎剥离椎旁的肌肉，暴露T9-11段的棘突及椎板，以微型咬骨钳咬除，将脊髓暴露，硬脊膜不能损伤，如大出血可用利多卡因止血，生理盐水冲洗保持视野干净清晰。采用改良式Allen打击装置，致伤量为5 g×8 cm，造成T9-11节段脊髓损伤。快速缝合伤口，碘伏消毒。等待大鼠苏醒。术后单笼饲养，保持垫料干燥，定时膀胱挤压帮助排尿。假手术组除不进行脊髓打击，其他操作同模型组。模型成功评价标准：①身体痉挛性颤动；②尾巴痉挛性摆动；③硬脊膜内充血或血肿，麻醉醒后双下肢表现为不完全瘫痪。

1.3.3干预方法

参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》选取大椎（第7颈椎棘突下，向下斜刺）、命门（第2腰椎棘突下，向上斜刺）两个督脉上的穴位，在固定时间给予治疗，每次20 min，每天1次，具体操作方法如下。

空白组：不用造模，相同饲养条件下不做任何干预，但在督脉电针组治疗时抓取进行束缚，每次20 min。

空白电针组：不用造模。选取大椎、命门，进针约0.5～0.7 cm。使用HANS-LH202型韩氏穴位神经刺激仪，上接阴极，下接阳极，持续脉冲电流，频率2 Hz，强度1 mA，治疗时间20 min，输出强度在刚开始时以背部肌肉出现轻微抽动为度，待其适应后则以双下肢瘫痪肌肉出现有节律的收缩为度。术后1 d组于造模清醒后2 h治疗1次，其余时间段每天固定时间治疗1次。

假手术组：去除T9-11段的棘突及椎板，不进行脊髓打击，术后不做任何处理，但在督脉电针组治疗时抓取进行束缚，每次20 min。

模型组：造模，术后不做任何处理，但在督脉电针组治疗时抓取进行束缚，每次20 min。

督脉电针组：造模，其他同空白电针组。

1.4评价方法

1.4.1BBB（Basso，Beattie，Bresnahan）评分

采用BBB评分对各组大鼠进行行为学评分。将大鼠后肢运动分为22个等级，后肢全瘫为0分，完全正常为21分，综合评定大鼠的运动功能。

1.4.2HE染色、尼氏染色

不同时间段组经处理后取每亚组大鼠6只，10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，待大鼠深度麻醉后固定于弓形板上行心脏灌注固定。打开胸腔，充分暴露心脏，用灌注针从左心室心尖部插入直至主动脉，剪开右心耳，灌注生理盐水约250 ml，待肝脏颜色呈灰白色且从心脏流出的液体由红色变成透明清亮的液体时，灌注4%多聚甲醛溶液约300 ml，时间30 min，待大鼠出现四肢抽搐及全身僵硬、肝脏变硬可停止灌注。卸下弓形板，以打击点为中心，剥离肌肉、脊椎，取出损伤脊髓节段（T9-11），约长1 cm，浸入4%多聚甲醛溶液中固定，将固定好的组织常规脱水，石蜡包埋，切片，厚4～5 μm，行HE染色和尼氏染色。

1.4.3Western blotting

取剩余每亚组大鼠6只，以10%水合氯醛3.5 ml/ kg腹腔注射麻醉后，剪下大鼠损伤脊髓节段，剔除肌肉与骨头，于无菌工作台冰盘上分离出脊髓组织进行研磨、提取组织蛋白，采用Bradford法测定蛋白含量，经电泳、电转、封闭，加入p75NTR一抗（1∶1000），封口，4℃孵育过夜，漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，漂洗，将PVDF膜放置ECL混合液中震荡温育5 min，于暗室压上X光片，感光数分钟，显影、扫描后，利用IPP软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析。

1.5统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，实验结果用（±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较时，数据呈正态分布并且方差齐时运用单因素方差分析，两组间比较用LSD检验。显著性水平α=0.05。

2　结果

2.1BBB评分

空白组与空白电针组术后各时间BBB评分均为21分。与空白组比较，假手术组经处理后BBB评分有所减少，术后7 d基本恢复到正常运动功能，评分为21分。

模型组与督脉电针组经造模后BBB分值明显减少。术后1 d两组BBB评分无显著性差异（P＞0.05），术后3 d督脉电针组BBB评分有上升趋势，但与模型组比较仍无显著性差异（P＞0.05），术后7 d督脉电针组BBB评分显著高于模型组（P＜0.001）。见表1。

2.2 HE染色

光镜下可见空白组、空白电针组和假手术组脊髓组织结构致密，灰质与白质之间界限清晰，灰质呈蝴蝶状，白质排列整齐，运动神经元形态规则，细胞核大且圆，核仁清晰。

术后1 d，模型组与督脉电针组均出现明显的损伤改变。模型组脊髓组织结构被破坏，灰质与白质分界不清，灰质内斑片状出血，大量红细胞聚集，灰质区域的运动神经元肿胀，细胞间质水肿，细胞核固缩，白质神经纤维肿胀增粗，排列紊乱；督脉电针组较模型组病理形态改变不明显，仍有出血、水肿。

术后3 d，模型组白质区域神经纤维继续肿胀增粗，组织结构排列紊乱稀疏，甚至有空洞形成，并且有小胶质细胞浸润，灰质部分大范围的运动神经元肿胀，甚至出现溶解，坏死，有白细胞浸润，中央管结构紊乱；督脉电针组较模型组出血现象相对减少，病理形态开始改善。

术后7 d，模型组出血减少，白质与灰质的边界仍然模糊不清，灰质部位神经元数量极少，大量小胶质细胞增生，白质神经纤维结构肿胀明显；督脉电针组较模型组出血少、小胶质细胞增生的数量少，神经元开始出现清晰的边缘。见图1。

2.3尼氏染色

光镜下可见空白组、空白电针组和假手术组脊髓组织灰质区域中的运动神经元胞浆中有呈蓝紫色的斑块状或条索状颗粒的尼氏体。术后1 d，模型组神经元数量减少，残存的神经元出现不同程度的肿胀，尼氏体染色细胞减少，甚至消失，染色变淡，在中央细胞核部位最为明显；督脉电针组较模型组病理形态改善不明显，神经元有减少、肿胀，尼氏染色较淡。术后3 d，光镜下可见模型组灰质区域中的神经元出现明显的萎缩，部分溶解，尼氏体数量显著减少，甚至消失；督脉电针组神经元萎缩、减少现象仍存在，但较模型组神经元减少数量少，且尼氏体隐约可见。术后7 d，光镜下可见模型组有少量神经元尼氏体重现；督脉电针组的尼氏体重现，较模型组明显。见图2。

2.4p75NTR的表达

术后各时间点，与空白组、空白电针组和假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织中p75NTR表达显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，督脉电针组p75NTR表达明显降低（P＜0.01）。

术后1 d，与空白组、空白电针组和假手术组比较，督脉电针组p75NTR表达升高，但无显著性差异（P＞0.05）。术后3 d，与空白组、空白电针组和假手术组比较，督脉电针组p75NTR表达显著升高（P＜0.001）。术后7 d；与空白组、空白电针组比较，督脉电针组大鼠脊髓组织中p75NTR表达明显升高（P＜0.01）；与假手术组比较，p75NTR表达有升高趋势，但无显著性差异（P＞0.05）。见表2、图3。

表1　各组大鼠术后不同时间段BBB评分

表2　各组大鼠术后不同时间段p75NTR的表达

图1　各组大鼠不同时间点受损脊髓（HE染色，bar=50 μm）

图3　各组大鼠受损脊髓组织p75NTR蛋白的表达情况

3　讨论

《灵枢·寒热病》记载，“身有所伤血出多，及中风寒，若有所堕坠，四支懈惰不收，名曰体惰”。其所描述的病因和症状与脊髓损伤相同。所以，脊髓损伤应归属中医的“体惰”范畴。其病机可归纳为督脉受损、肾阳不足、气血不畅、筋脉失养。故治疗当疏通督脉、温肾壮阳、活血化瘀。在此原则指导下，即以督脉上的大椎、命门二穴作为针刺部位。

脊髓损伤后，损伤区域由于血管受损、闭塞甚至痉挛，使得脊髓自身的调节机制被创伤性的低血压所破坏，失去低碳酸反应，不能将自身的血流量维持在正常的水平［18］，因而会造成微循环障碍甚至血栓形成；而这些病理改变会进一步使微循环障碍及组织缺血程度加重［18］；同时炎性细胞及神经胶质细胞的浸润导致局部的组织水肿，血管阻力进一步增加，造成灌注紊乱；而受损脊髓的局部组织缺血以及延迟性低灌流会造成受损脊髓的神经细胞发生坏死，神经功能逐渐丧失，所支配的运动功能发生障碍。

本实验通过光镜观察脊髓损伤大鼠受损脊髓组织，发现切片中呈现出明显的出血、水肿以及神经元的变性坏死等现象，其损伤的主要病理变化以神经元的溃变为主，结果与国内外学者的研究［19-21］相一致。督脉电针治疗后7 d，能够明显阻止脊髓损伤大鼠受损脊髓发生继发性损伤，并促进损伤神经元的修复。这些结果可能与其能够扩张血管，使血液流变性，使微循环得到改善，使血小板的聚集现象受到抑制，使血栓得到溶解以及使受损的神经组织细胞缺氧状况得到改善等分不开。

神经元损伤后，除一些酶活性的变化可以反映脊髓损伤后神经元的损伤情况之外，神经元的尼氏体数量和含尼氏体神经元的多少也可以用来作为判断神经损伤程度的指标［22-23］。尼氏体正常情况下数量较多、颗粒较大，分布于神经元的核周部。在本实验中模型组含有尼氏体的神经元显著少于空白组、空白电针组和假手术组，而且形态不规则，甚至有较多的失去完整形态，位于神经元胞浆内的尼氏体染色较浅。经过1 d、3 d和7 d的电针治疗后，微环境的情况得到一定程度改善，部分神经元被激发出较强的修复再生能力，加速神经元修复，细胞核及尼氏体等细胞器重新出现，进而使神经元内的蛋白质合成功能逐渐恢复，具有一定的保护神经元、促进神经元再生修复及稳定神经元结构的作用。

细胞凋亡是一种自然的生理过程，在神经系统的发育过程中对神经元的生长、发育、分化及维持细胞的数目与质量、稳定突触的联系及神经内环境有着重要的作用［12］。脊髓损伤导致的神经功能永久或长期丧失与脊髓组织的水肿、变性、坏死，以及神经元与少突胶质细胞的凋亡有关［12，24］。

Rabizadeh等首次证实p75NTR介导细胞凋亡［25］。在中枢神经系统损伤中，p75NTR在非损伤脊髓中没有发现表达，在损伤的脊髓中发现表达［12］。本实验各时间窗结果显示，模型组大鼠受损脊髓组织p75NTR表达较空白组、空白电针组及假手术组增多；而督脉电针组较模型组p75NTR表达相对减少。从实验结果还可以看出，模型组大鼠p75NTR在3 d时表达达到最高峰，7 d时已回落，督脉电针组在7 d也下调p75NTR水平至相对正常水平，与假手术组比较无显著性差异。随着损伤时间的延长，模型组p75NTR水平也相应回落，但仍较未受损大鼠p75NTR表达高。说明督脉电针可以下调受损脊髓组织中p75NTR的表达水平。结合行为学、病理形态学结果，我们推测脊髓损伤后大鼠受损局部p75NTR蛋白高水平表达，而通过督脉电针的干预治疗可以下调受损脊髓局部p75NTR蛋白的表达，从而为神经元的修复提供合适的环境。

综上所述，本实验的造模会造成大鼠受损局部脊髓一定程度的损害，假手术组也会因为手术操作而造成大鼠运动功能短期内的下降。督脉电针干预可以减轻脊髓损伤程度。脊髓损伤后受损局部p75NTR蛋白呈升高趋势；督脉电针干预可显著下调各时间点p75NTR蛋白的表达。抑制p75NTR蛋白的表达可能是督脉电针发挥保护受损脊髓神经作用的机制之一。

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Effects of Governor Vessel Electroacupuncture in Different Time Points on Motor Functions and p75 Neurotrophin Receptor after Spinal Cord Injury

LÜ Wei1a，MO Yu-ping2，LI Bing1b，YAO Hai-jiang3，4，JING Quan-kai1a，SONG Liang-yu1a，WANG Xin1a，MAO Ying-qiu1c，LI Zhi-gang1a，SHI Su-hua5
1.a.Department of Acupuncture and Massage，b.Department of Basic Medicine，c.Scientific Research and Test Center，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2.The Rehabilitation Department of the Third People's Hospital of Shenzhen City，Shenzhen，Guangdong 518112，China；3.Treatment Center of Traditional Chinese Medicine，Beijing Bo'ai Hospital，China Rehabilitation Research Center，Beijing 100068，China；4.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine，Beijing 100068，China；5.Department of Rehabilitation，The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Correspondence to LI Zhi-gang，SHI Su-hua.E-mail：lizhigang620@126.com（LI Zhi-gang）；molly-flower@163. com（SHI Su-hua）

Objective To explore the effect of Governor Vessel electroacupuncture in different time points on motor function and p75 neurotrophin receptor（p75NTR）after spinal cord injury.Methods A total of 180 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups（one day，three days and seven days after modeling），and each group was divided into normal control group，normal electroacupuncture group，sham operation group，model group and Governor Vessel electroacupuncture group with 12 cases in each group.The spinal cord injury model was established with the modified Allen's method.The normal electroacupuncture group and the Governor Vessel electroacupuncture group received electroacupuncture on Dazhui（DU14）and Mingmeng（DU04）acupoints.Basso-Beattic-Bresnahan（BBB）Scale was performed to assess the motor function of rats.The expression of p75NTRwas detected with Western blotting.Results The BBB score of the model group and the Governor Vessel electroacupuncture group were significantly lower than that of the other three groups.TheBBB score was significantly higher in the Governor Vessel electroacupuncture group than in the model group seven days after intervention （t=-4.510，P＜0.001）.The expression of p75NTRwas siginificantly lower in the Governor Vessel electroacupuncture group than in the model group（P＜0.01）.Conclusion The expression of p75NTRincreased after spinal cord injury.Governor Vessel electroacupuncture could improve the motor function，and inhibit the p75NTRexpression of damaged spinal cord tissues.

spinal cord injury；Governor Vessel；electroacupuncture；p75 neurotrophin receptor；apoptosis；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.08.002

国家自然科学基金项目（No.81373728）。

1.北京中医药大学，a.针灸推拿学院，b.基础医学院，c.科研实验中心，北京市100029；2.深圳市第三人民医院康复科，广东深圳市518112；3.中国康复研究中心北京博爱医院中医治疗中心，北京市100068；4.首都医科大学康复医学院，北京市100068；5.北京中医药大学第三附属医院康复科，北京市100029。作者简介：吕威（1988-），男，回族，河南驻马店市人，硕士研究生，主要研究方向：针刺干预中枢神经系统损伤的机理研究。通讯作者：时素华（1981-），女，主治医师，国家自然科学基金主持人，主要研究方向：针刺干预中枢神经系统损伤的机理研究。李志刚（1965-），男，教授，主任医师，博士研究生导师，博士后合作导师，主要研究方向：针刺手法及针刺干预中枢神经系统损伤的机理研究。E-mail：molly-flower@163.com（时素华）；lizhigang620@126.com（李志刚）。

R651.2

A

1006-9771（2016）08-0876-08

（2016-04-11

2016-06-14）