上海市屠宰生猪丹毒丝菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌分离情况调查

沈莉萍，徐　锋，宁　昆，王晓旭，刘佩红（上海市动物疫病预防控制中心，上海　201103）

上海市屠宰生猪丹毒丝菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌分离情况调查

沈莉萍，徐锋，宁昆，王晓旭，刘佩红
（上海市动物疫病预防控制中心，上海201103）

为了解上海市屠宰场屠宰生猪丹毒丝菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌的分离情况，采取传统方法进行细菌分离，利用全自动微生物生化鉴定系统、全自动快速微生物质谱检测系统、普通PCR方法进行细菌鉴定。结果发现猪丹毒丝菌分离率为61%，猪链球菌分离率为7%，副猪嗜血杆菌分离率1%；猪丹毒丝菌从肺脏、扁桃体中均分离到，分离率高，猪链球菌和副猪嗜血杆菌从扁桃体中分离到，分离率低。

屠宰生猪；猪丹毒丝菌；猪链球菌；副猪嗜血杆菌；上海

猪丹毒丝菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌的天然定植部位均为猪上呼吸道。当猪机体抵抗力下降或者发生免疫抑制病时，这些细菌会作为致病菌侵入机体导致发病，影响猪的生长，严重的会导致猪突然死亡，给猪场造成经济损失。猪扁桃体位于消化道和呼吸道的交汇处，是多种病原微生物侵袭、复制和定居的重要场所，采集猪扁桃体样品，可以进行猪群疫病病原感染状况的调查。近年来，大部分猪场都对猪病毒病比较关注，而忽视了对细菌病的预防和控制。本研究旨在调查上海市屠宰场屠宰生猪的肺脏和扁桃体中上述三种细菌的分离情况，为猪场进行细菌病的防控提供数据支持。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源。2015年4月采集A、B屠宰场屠宰生猪肺脏和扁桃体各10份，共40份；10月采集A、C屠宰场屠宰生猪肺脏和扁桃体各15份，共60份。所有样本放置冷藏箱运到实验室，当天进行检测。

1.1.2 培养基和试剂。麦康凯琼脂、三糖铁琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、明胶、卡那霉素、新霉素、万古霉素等，购自北京陆桥技术有限公司；Columbia血琼脂基础、叠氮钠血琼脂基础，购自BD公司；辅酶Ⅰ（NAD），购自上海如吉生物科技发展有限公司；脱纤维羊血，购自闵行区诸翟无菌动物血试剂供应站；马血清（HyClone），购自Thermo；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；Premix购自TaKaRa公司；革兰氏阳性细菌鉴定卡（GP）、质谱样品处理基质溶液（VITEK MSCHCA），购自生物梅里埃公司。

1.1.3 标准菌株。副猪嗜血杆菌HP80由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠；猪链球菌标准株SS2 由德国吉森大学Baljer 教授惠赠；猪丹毒丝菌C43-5购自中监所。

1.1.4 仪器。全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）、全自动快速微生物质谱检测系统（VITEK MS）、普通PCR仪（BioRad PTC-200）、恒温箱（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 样品采集和处理。用灭菌剪刀和镊子采集屠宰生猪扁桃体和肺脏组织于采样袋中；样品经灭菌生理盐水冲洗后进行检测。

1.2.2 细菌分离培养。第一步，副猪嗜血杆菌分离培养。无菌采取扁桃体和肺脏组织涂抹接种于Columbia血平板（含1 µL/mL NAD），在5% CO2培养箱中经36 ℃培养48 h，对可疑菌落进行革兰氏染色镜检；挑取单个菌落接种于Columbia血平板（含1 µL/mL的NAD）进行纯培养，观察菌落特征、染色特点。第二步，猪链球菌分离培养。无菌采取扁桃体和肺脏组织，先涂抹，后划线接种于Columbia血平板，在5% CO2培养箱中经36 ℃培养24 h，对可疑菌落进行革兰氏染色镜检；挑取单个菌落接种于Columbia血平板进行纯培养，观察菌落特征、染色特点。第三步，猪丹毒丝菌分离培养。无菌剪取扁桃体和肺脏组织各约1 g，加入9 mL TSB（含5%的马血清、400 mg/L卡那霉素、50 mg/L新霉素、25 mg/L万古霉素）中，36 ℃培养18～24 h。用接种环挑取增菌肉汤接种到叠氮钠血琼脂基础（2%脱纤维绵羊血和5%马血清），在5% CO2培养箱中经36 ℃培养24～48 h，对可疑菌落进行革兰氏染色镜检；挑取单个菌落接种于Columbia血平板进行纯培养，观察菌落特征、染色特点。

1.2.3 生化试验和细菌鉴定。对疑似猪丹毒丝菌分离株接种于麦康凯、三糖铁、明胶培养基，观察其培养特性。对疑似猪丹毒丝菌和猪链球菌的分离株，采用全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）和全自动快速微生物质谱检测系统（VITEK MS）按照操作步骤进行鉴定，读取鉴定结果。

1.2.4 PCR检测。首先，进行细菌基因组DNA的提取。用煮沸法制备DNA 模板，挑取数个菌落于含100 µL ddH2O的EP管中，100 ℃水浴10 min，12 000 r/min离心5 min，吸取上清作为模板，置-20 ℃保存备用。其次，引物合成、反应体系和条件。分别合成猪链球菌、副猪嗜血杆菌引物［1-2］（表1），PCR反应体系均为25 µL。猪链球菌反应体系为：premix 12.5 µL，ddH2O 8.5 µL，引物各0.5 µL，模板2 µL；反应条件为：94 ℃预热5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增30个循环；72 ℃延伸10 min。副猪嗜血杆菌反应体系为：premix 12.5 µL，ddH2O 8.5 µL，引物各1 µL，模板2 µL；反应条件为：95 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃1.5 min，扩增30个循环； 72 ℃延伸10 min。

表1　猪链球菌、副猪嗜血杆菌PCR引物序列

2　结果

疑似猪链球菌分离株在Columbia血平板上为灰白色、湿润、表面光滑、边缘整齐、α溶血、1 mm大小的菌落，革兰氏染色镜检为G+球形或椭圆形、短链。将疑似分离株进行猪链球菌二重PCR检测，结果在4月份的10份扁桃体样品中检测到7份阳性，经VITEK2-Compact和VITEK MS鉴定，均为猪链球菌。

疑似副猪嗜血杆菌分离株在Columbia血平板（含NAD）上为不溶血、半透明、针尖大小菌落，革兰氏染色镜检为G- 细杆、呈长杆至长丝状。将疑似副猪嗜血杆菌分离株进行PCR检测，结果在4月份的10份扁桃体样品中检测到1份阳性，其余均为阴性。

疑似猪丹毒丝菌分离株在叠氮钠血琼脂基础上为圆形、灰色、1～2 mm大小，有透明溶血圈菌落，革兰氏染色镜检为G+ 呈平直、微弯曲杆菌或长丝状；在Columbia血平板上为圆形、光滑、半透明、针尖大小菌落，培养48 h后出现狭窄绿色溶血环（需对光观察）；在麦康凯上不生长，在三糖铁琼脂上斜面和底层变黄，底部黑色，有H2S产生；明胶穿刺22 ℃培养72 h，明胶不液化，有的细菌呈试管刷状生长，经VITEK2-Compact和VITEK MS鉴定，均为猪丹毒丝菌。

从时间看（表2），4月份的扁桃体样品中分离到猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪丹毒丝菌，分离率分别为14%、2%和55%；4月份的肺脏样品中分离到猪丹毒丝菌，分离率为20%；10月份的扁桃体和肺脏样品中均分离到猪丹毒丝菌，分离率高，没有分离到猪链球菌和副猪嗜血杆菌。

表2　不同时间屠宰生猪细菌检测结果

从不同屠宰场看（表3），3家屠宰场分离到猪丹毒丝菌，2家屠宰场分离到猪链球菌，1家屠宰场分离到副猪嗜血杆菌，仅1家屠宰场的扁桃体样品中同时分离到3种细菌。

表3　不同屠宰场屠宰生猪细菌检测结果

3　讨论

猪丹毒诊断技术（NY/T 566—2002 ）中分离猪丹毒丝菌的培养基为马丁琼脂和马丁肉汤［3］，而本研究采用含有一定浓度的马血清、抗生素的TSB进行增菌，含羊血和马血清的叠氮钠血琼脂基础进行猪丹毒丝菌分离。事实证明，由于样品来源于屠宰车间，污染大，通过用灭菌生理盐水进行冲洗，在含有抗生素的TSB中增菌，降低了杂菌污染的风险，在含羊血和马血清的叠氮钠血琼脂基础进行分离，杂菌少，猪丹毒丝菌的溶血圈大，菌落大，易于观察，不易漏检；使用Columbia血平板进行纯培养，培养时间长，菌落小，溶血圈为狭窄的绿色溶血环，需对光观察。因此，对于样品污染严重，可按照上述方法进行猪丹毒丝菌的增菌和分离，对病料，可直接选择叠氮钠血琼脂基础进行分离培养。

据报道，猪丹毒丝菌可以在健康猪的扁桃体中潜伏，扁桃体中的带菌率为24.3%～70.5%［4］，本研究的3家屠宰场中有2家分离率大于40%以上，与傅启勇等［5］报道的52%、60%、70.45%分离率相吻合。猪丹毒丝菌目前共有25个血清型，从健康猪的扁桃体可分离出不同的血清型［6］。本研究所分离的菌株属于哪些血清型，是否致病，需下一步对此展开研究。

从扁桃体中均分离到猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪丹毒丝菌，而且3家屠宰场生猪扁桃体样品中猪丹毒丝菌的分离率比肺脏样品中高，因此建议采集屠宰生猪的扁桃体同时进行三种细菌的分离，以减少工作量；扁桃体采集质量要多，采集后迅速进行实验室检测，可提高检出率。另外，在4月份均分离到这3种细菌，而在10月份仅分离到其中1种细菌。原因有可能是上海市4月份正是初春季节，气候多变，昼夜温差大，对猪应激大，育肥猪多处于亚健康状态，携带的细菌多，而10月份气候温暖干燥，育肥猪健康。因此在4月份比10月份更容易分离这3种细菌。屠宰场中B屠宰场同时分离到3种细菌，C屠宰场分离到其中1种细菌。追踪屠宰生猪来源发现，C屠宰场屠宰生猪均来自同一企业自繁自养育肥猪，B屠宰场来自不同养殖场，养殖环境、饲养管理模式不同，分离的细菌也不同。

猪链球菌和副猪嗜血杆菌的天然定植部位是猪上呼吸道，尤其扁桃体，但本研究的分离率非常低，尤其副猪嗜血杆菌仅分离到1株。张悦等［7］在2013—2014年从上海市5家屠宰场采集的8批次鼻拭子和病变肺组织样品中，仅从2家屠宰场的3批次分离到副猪嗜血杆菌，分离率为12%～20%，其余5批次没有分离到副猪嗜血杆菌，养殖场疑似病料分离率也仅为29.3% 。这可能与猪链球菌和副猪嗜血杆菌培养条件要求严格有关。尤其副猪嗜血杆菌培养条件苛刻，在室温下仅少量存活，需要在体内环境中生长［8］，体外存活时间短，样品需要在没有使用抗生素之前采集。目前没有找到添加何种抗生素可进行副猪嗜血杆菌增菌，直接进行平板培养，如果采集的样品污染严重，则分离更加困难。今后需加强对猪链球菌和副猪嗜血杆菌增菌培养的研究。

本研究曾采集屠宰生猪鼻拭子进行检测。但是在样品采集过程中发现，生猪屠宰都是流水线操作，棉签仅采集鼻腔浅表部位，无法深入到鼻腔深部，杂菌多，导致目的菌的分离工作量大，难度大，极易漏检，检测结果不确实。因此，屠宰生猪鼻拭子不适宜进行细菌分离。

［1］ 万世平，王建，葛菲菲，等.副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用［J］.动物医学进展，2009，30（1）：9-12.

［2］ 李小军.上海地区猪链球菌致病性血清型及其毒力因子的流行病学调查［D］.南京：南京农业大学，2007.

［3］ 农业部. 猪丹毒诊断技术：NY/T 566—2002［S］.北京：中国标准出版社，2002.

［4］ 宣长和. 猪病学［M］.2版.北京：中国农业出版社，2003：109.

［5］ 傅启勇，张孟刚，范翔九，等.猪丹毒杆菌的公共卫生学意义的研究--动物带菌率与环境污染情况的调查［J］.中国人畜共患病，1985（2）：9-12.

［6］ 陆承平. 兽医微生物学［M］.5版.北京：中国农业出版社，2013：181-182

［7］ 张悦，李蓓蓓，魏建超，等.上海副猪嗜血杆菌分离鉴定及其耐药性分析［J］.中国动物传染病学报，2015，23（4）：25-30.

［8］ 赵德明，张仲秋，周向梅. 猪病学［M］.10版.北京：中国农业大学出版社，2014：800-801.

（责任编辑：杜宪）

Investigation of Erysipelothrix Rhusiopathiae，Streptococcus Suis and
Haemophilus Parasuis in Commercially Slaughtered Pigs from Shanghai City

Shen Liping，Xu Feng，Ning Kun，Wang Xiaoxu，Liu Peihong
（Shanghai Animal Disease Control Center，Shanghai 201103）

To investigate the prevalence of Erysipelothrix rhusiopathiae，streptococcus suis haemophilus parasuis from commercially slaughtered pigs in Shanghai. Bacteria was isolated by the traditional method and identified by automatic microbial identification system，organisms rapid identification system and PCR.The isolation rate was 61% for Erysipelothrix rhusiopathiae，7% for Streptococcus suis and 1% for Haemophilus parasuis.Erysipelothrix rhusiopathiaes showed a higher isolation rate on lung and tonsil，while streptococcus suis and haemophilus parasuis can only be isolated from tonsil and showed a lower separation rate.

commercially slaughtered pigs；erysipelothrix rhusiopathiae；streptococcus suis；haemophilus parasui；Shanghai

S851.3

B

1005-944X（2016）08-0031-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.008

上海地区主要动物病原微生物种质资源保存利用（沪农科攻字〔2014〕第7-3-3号）

刘佩红