HPLC法同时测定黄芪中的5种黄酮类成分的含量——一种新的应用于药学实验分析方法

刘小花, 崔　方, 张梦婷, 王　影, 封士兰

(兰州大学 药学院, 甘肃 兰州　730000)



HPLC法同时测定黄芪中的5种黄酮类成分的含量
——一种新的应用于药学实验分析方法

刘小花, 崔方, 张梦婷, 王影, 封士兰

(兰州大学 药学院, 甘肃 兰州730000)

高效液相色谱技术是药学院本科生仪器分析的必修内容。采用高效液相色谱法同时测定黄芪中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮和芒柄花素的含量,该方法操作简便,重复性好,结果准确可靠,不仅用于黄芪药材中黄酮类成分的含量测定,也可用于药学院分析化学、制剂分析等学生实验,让学生掌握高效液相色谱技术。

药物检测； 黄芪； 黄酮类成分； HPLC

高效液相色谱法(high performance liquid Chromatography, HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。2010版中国药典中80%以上的中药材和制剂其含量测定项均采用高效液相色谱法,高效液相色谱技术是药学院本科生及研究生仪器分析的必修内容,也是制剂分析、药物分析和现代色谱分析的常规方法,因此掌握高效液相色谱技术对于药学类技术人才是必要的。

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch. )Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根, 具有补气固表、 利尿托毒、排脓、 敛疮生肌等功效[1]。其主要化学成分包括黄酮类化合物、黄芪多糖以及黄芪皂苷等。黄芪主产于我国甘肃、内蒙和山西三省,不同地区的黄芪质量有一定的差别[2]。

房树标等[3]利用紫外分光光度法测定了黄芪药材中总黄酮的含量,但是此法对于黄芪药材中的多种黄酮类成分无法进行同时测定。石子仪等[4-5]采用HPLC-DAD法建立芒柄花素以及毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷等黄酮类成分的含量测定方法。赵强强等[6-11]采用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷等皂苷类成分的含量。2010版中国药典已将黄芪甲苷和毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷作为指标成分控制黄芪药材及其制剂的质量。本实验首次在黄芪药材中鉴别出金雀异黄酮,并建立同时测定包括金雀异黄酮在内的5个黄酮类成分含量的方法。本实验中心进行了天然药物化学本科生综合实验和设计性实验改革[12-13],取得不错成绩。

1　实验

1.1仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪系列:Millennum32 在线工作站,在线脱气机,四元泵,2771自动进样器,柱温箱,2998二极管阵列检测器；SpursilTMC18 柱(250 mm×4.6 mm, 5μm,北京迪马有限公司)；乙腈为色谱纯(美国迈瑞达科技有限公司)；甲醇为色谱纯(美国迈瑞达科技有限公司)；水为超纯水；95%乙醇为分析纯；电热恒温水浴锅；KQ3200DB 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

对照品毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、金雀异黄酮均购自中国食品药品检定研究院。

黄芪药材(7批),自采或购买,具体产地见表1,经兰州大学药学院生药研究所马志刚教授鉴定为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

表1　黄芪药材来源与品种

1.2色谱条件

SpursilTMC18 柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相为乙腈(A)和水(B),其梯度洗脱条件见表2；柱温为30 ℃；检测波长范围为210～400 nm；2998二极管阵列检测器；进样量为10 μL。

表2　梯度洗脱条件

1.3对照品溶液配制

分别取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、金雀异黄酮标准品适量,用甲醇配制成质量浓度分别为0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 g/L的对照品溶液,置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.4样品处理

称取黄芪药材2 g,以10倍量(20 mL)的95% 乙醇回流提取,每次1 h,共提取3次,过滤并合并提取液,将合并液置水浴锅上蒸馏浓缩至近干;干样品用95% 乙醇溶解,转移至10 mL量瓶中,定容至刻度,摇匀,即得药材的乙醇提取液(供试品溶液)。微孔滤膜(0.45 μm)滤过后以封口胶封存,置4 ℃冰箱冷藏备用。7批药材均按上述过程处理。

2　方法学考察

2.1线性关系考察

分别取对照品储备液并用甲醇逐级稀释成一系列不同浓度对照品溶液,进样5 μL进行测定,梯度洗脱条件见表2。5种黄酮类化合物以进样量(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归分析,结果见表3。各回归方程呈现良好的线性关系。

表3　对照品的回归方程

注:表中F1—F5分别为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素。

2.2稳定性考察

同一样品分别在0、2、4、6、12、24 h进样10 μL,记录峰面积,F1—F5对照品的RSD(%)分别为1.82%、0.76%、1.75%、1.60%、1.96%,所有的RSD<2%,符合规定。

2.3精密度考察

取对照品溶液测定日内精密度和日间精密度。同一对照品溶液在同一天内连续进样6次,每次进样5μL,计算日内精密度。同一对照品溶液连续3 d每天进样2次,计算日间精密度。实验结果表明,5个黄酮类化合物的日内和日间精密度的RSD<2%,符合规定。

2.4重复性考察

取1号黄芪药材(来源于华亭马峡)6份,每份2 g,精密称定,制备成供试品溶液,按照样品测定方法测定。测得F1—F5的5个黄酮类化合物的平均含量和RSD。测定结果表明,5种化合物的RSD<2%,重复性符合规定。

2.5准确度考察

以加样回收率考察准确度。取同一批已知含量的1号(华亭马峡)黄芪药材5份,每份2 g,精密称定,各加入适量的各种对照品溶液(F1—F5质量浓度分别为0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 g/L)按照上述的对照品溶液制备中的操作测定,计算5个成分的加样回收率,结果表明,5个黄酮类成分的平均回收率都在96.86%～101.09%,RSD<2%,符合规定。

2.6样品测定

取7批黄芪药材,制备成样品溶液,精密吸取10 μL进入HPLC仪进行分析,测得的色谱图见图1,与标准溶液的对比见图2,毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素的保留时间tR和含量测定结果见表4。

图1　7批黄芪药材提取物HPLC-DAD 色谱图(254 nm)

图2　药材与5个黄酮类成分HPLC-DAD 色谱图(254 nm)

分析物tR/min5种黄酮类成分的含量/(μg·g-1)样1样2样3样4样5样6样7F16.4684.14350.09126.10213.62411.42222.09295.54F213.1432.71115.82104.10106.98189.56136.9957.82F316.6654.23256.077.7315.6629.8826.53168.52F421.011.011.360.871.431.751.821.03F526.7415.40120.861.49018.8523.0683.99

由图1和图2可知,黄芪药材提取物的HPLC-DAD指纹图谱中有5个共有峰,通过与标准品比对,F1—F5号峰对应的化合物分别为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素。

3　实验结果与讨论

3.1提取方法评价

采用95%乙醇作为溶剂,对7批来自不同产地的黄芪药材进行回流提取, 5个黄酮类成分在该提取条件下得到的峰面积较大,提取效果良好,操作简单。

3.2检测系统评价

采用HPLC-DAD法对7批来自不同产地的黄芪药材进行黄酮类成分的含量测定,测得各对照品——毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素的最大吸收波长分别为258.1、249.8、248.7、259.3、248.7 nm。本实验选取254 nm为检测波长,对这5个黄酮类成分进行测定,其结果准确,重复性好。说明将HPLC-DAD法应用于黄芪药材中黄酮类成分的质量控制中效果好。

3.3含量测定分析

测定显示黄芪药材内的5种黄酮类成分含量大小关系为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量>毛蕊异黄酮含量>芒柄花苷含量>芒柄花素含量> 金雀异黄酮含量。其中,7批药材中的金雀异黄酮含量均少于2 μg/g,而以往的学者做黄芪药材中成分测定时,选用的对照品在药材中的含量往往比较高,因此金雀异黄酮的峰形不易被发现。

此外,从表4中可发现,即使是同一化合物在7批不同的黄芪药材中的含量有较大的差异,这可能与黄芪的生长环境、生长年限以及储藏时间等因素有关。

2010版药典将黄芪甲苷以及毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量作为黄芪药材的质量控制标准。本研究在黄芪药材中同时测定了金雀异黄酮等5个黄酮类成分的含量,为多指标控制黄芪药材的质量提供了实验基础。

4　结语

高效液相色谱法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术,也是药物检测必备的现代分析技术。本实验方法的建立充分利用现代技术手段,使学生了解和应用当前新技术,牢固掌握所学的理论知识,实现了药学院本科生及研究生的仪器分析、制剂分析、药物分析和现代色谱分析等实验内容的改进,为培养高素质的掌握现代分析手段的药学类技术人才创造了条件。

References)

[1] 中华人民共和国药典委员会.中国药典一部[M].北京:化学工业出版社,2005:212-213.

[2] Pui Ying Yip, Hoi Shan Kwan. Molecular identification of Astragalus membranaceus at the species and locality levels [J]. J Ethnophar, 2006(106):222-229.

[3] 房树标,李艳彦,刘必旺,等.紫外分光光度法测定蒙古黄芪中总黄酮的含量[J].中国药物与临床,2007,7(12):899-901.

[4] 石子仪,鲍忠,姜勇,等. 不同来源黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的定量分析[J].中国中药杂志,2007,32(9):779-783.

[5] 姚雪莲,裴彩云,王宗权.不同产地、不同采收期黄芪药材及饮片中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素含量测定[J].药物分析杂志,2012,32(5):797-801,805.

[6] 赵强强,韩丽,欧水平. HPLC-ELSD法测定黄芪提取物中黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ及乙酰黄芪皂苷[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(11):56-58.

[7] 汪红,王强.HPLC-ELSD法测定黄芪及其注射液中黄芪皂苷Ⅳ、Ⅲ和Ⅰ的含量[J].中国药学杂志,2002,37(4):298-300.

[8] 赵灵芝,朱丹妮,严永清. HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J].药物分析杂志,1999,19(6):403-405.

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[13] 刘小花,胡芳弟,崔方,等.将芦丁提取分离实验打造为综合设计性实验[J].实验技术与管理,2012,29(10):160-162.

A new analysis method for pharmaceutical student experiment by HPLC to simultaneously determine five flavonoids’ compounds in RadixAstragali

Liu Xiaohua, Cui Fang, Zhang Mengting, Wang Ying, Feng Shilan

(School of Pharmacy,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

High performance liquid chromatography (HPLC) technique is the compulsory courses of instrument analysis to undergraduates. The content determinations of more than 80% of Chinese herbs and preparations in the Chinese pharmacopoeia 2010 are using HPLC, so it is necessary to master the HPLC technique for training the pharmaceutical talents. The analysis of experimental method is established to simultaneous determination of five flavonoids’ compounds in RadixAstragaliby HPLC, and the method is simple and reproducible. It can be used as principles of quantitative analysis to flavonoids compounds of RadixAstragali, also as student analytical experiments of chemistry and preparation analysis in order to improve students grasping the technology of HPLC.

pharmaceutical determination; RadixAstragali; flavonoids; HPLC

10.16791/j.cnki.sjg.2016.02.008

实验技术与方法

2015- 07- 08修改日期：2015- 08- 27

中央高校基本科研业务费专项资金项目( lzujbky-2015-59)

刘小花(1976—),女,甘肃兰州,博士,高级实验师,兰州大学药学院实验中心副主任,研究方向为药物分析.

E-mail:liuxiaoh@lzu.edu.cn

R284.1

B

1002-4956(2016)2- 0024- 04