银杏叶提取物与其黄酮类物质抗氧化作用的比较*

宋唯唯　刘芬芬　刘彩红

(泰山医学院药学院，山东泰安　271016)



银杏叶提取物与其黄酮类物质抗氧化作用的比较*

宋唯唯刘芬芬刘彩红

(泰山医学院药学院，山东泰安271016)

目的比较银杏叶提取物与其总黄酮的抗氧化能力。方法用流动注射化学发光法和紫外分光光度法检测银杏叶提取物及其总黄酮清除O2-·、·OH和DPPH·的能力。结果银杏叶提取物及其总黄酮对O2-·、·OH和DPPH·三种自由基均有一定的清除作用，且清除作用随浓度的增加而增加；当二者总黄酮醇苷浓度相同时，银杏叶提取物对三种自由基的清除能力均高于其总黄酮。结论银杏叶提取物的抗氧能力强于银杏叶提取物总黄酮。

银杏叶提取物；银杏叶黄酮；抗氧化

银杏叶提取物(Ginkgo biloba extracts，EGB)是银杏的干燥叶经提取纯化后得到的浅黄色粉末，具有抗肿瘤、清除自由基、抗氧化等药理作用[1-2]。研究表明EGB能够有效清除活超氧阴离子自由基、过氧自由基及NO自由基，具有抗氧化损伤作用[3-4]。EGB中主要活性成分为黄酮醇苷类和萜内酯类化合物，且标准EGB中银杏总黄酮含量不少于24%。众所周知，黄酮类物质具有很好的抗氧化作用，如果能够明确EGB与其总黄酮抗氧化能力的强弱，必将对EGB进一步的临床应用及EGB产品的开发提供帮助。为更好地开发和利用EGB这一药用资源，本研究采用流动注射化学发光法和紫外分光光度法，比较了EGB与其黄酮类物质对活性氧自由基(O2-·，·OH)和对DPPH自由基的清除能力。

1　仪器与试剂

1.1试剂对照品槲皮素、山柰素和异鼠李素购自中国药品生物制品检定所；银杏叶提取物购自西安昌岳植物化工有限公司；鲁米诺(Sigma公司)；DPPH(北京中生瑞泰科技有限公司)；邻苯三酚、维生素C、铁氰化钾、过氧化氢、磷酸、无水乙醇等试剂均为分析纯；甲醇为色谱纯；实验用水均为二次蒸水。

1.2仪器IFFM-D型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈科技有限公司)；大连依利特EC2006高效液相色谱仪，包括UV230II紫外-可见检测器。

2　方法

2.1溶液的配制用甲醇配制槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品储备液，置于棕色容量瓶中，4℃保存，备用。邻苯三酚溶液用1 mmol·L-1的HCl配制，使用前用水稀释至所需浓度；鲁米诺用0.1 mol·L-1NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液配制成所需浓度；亚铁氰化钾、H2O2用KH2PO4-NaOH(pH=7.20)缓冲溶液配制，临用前配制。精密称取4 mg DPPH试剂，置于250 ml棕色容量瓶中，用无水乙醇定容，4℃保存，备用。

2.2银杏叶提取物总黄酮的制备称取6 g银杏叶提取物于300 ml、60℃的热水中溶解，并快速冷却至室温，用150 ml正丁醇萃取，重复操作共四次，收集正丁醇层，然后60℃下减压浓缩干燥即得EGB黄酮。

2.3黄酮醇苷含量测定用HPLC法测定总黄酮醇苷的含量。采用Hypersil ODS2色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)，流动相甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)，检测波长360 nm，流速1.0 ml/min。用外标法计算样品中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量，按总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51计算。EGB中总黄酮醇苷含量为24.76%，EGB黄酮中总黄酮醇苷含量为32.5%。

2.4抗氧化能力的检测

2.4.1O2-·清除能力检测 邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生O2-·，O2-·与鲁米诺反应，可发出化学冷光，用发光检测装置可测定发光强度。采用我们在文献中[5]所述的测定条件及流动注射化学发光流路(图1)进行测定。流路中a、b、c分别为邻苯三酚溶液、鲁米诺-碳酸盐缓冲液和H2O。当蠕泵中进的是空白溶液时，发光信号为空白值I0，当进的是样品溶液时，发光信号记为IT。

O2-·清除率=[(I0-IT)/I0]×100%

图1　流动注射化学发光示意图

P蠕动泵；V进样阀；E流通池；W废液；PMT光电倍增管；HV负高压；R记录仪

2.4.2·OH清除能力检测采用亚铁氰化钾-鲁米诺- H2O2体系测定，由Fenton体系产生·OH，鲁米诺为发光增效剂。采用的流动注射化学发光流路与2.4.1相同，流路中a、b、c分别为鲁米诺、亚铁氰化钾溶液和H2O2溶液。当蠕泵中进的是空白溶液时，发光信号为空白值I0，当进样品溶液时，发光信号记为IT。

·OH清除率=[(I0-IT)/I0]×100%

2.4.3DPPH·清除能力检测将2 ml样品溶液及 1 ml DPPH溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置 30 min后测定其吸光度A1,同时测定 1 ml DPPH溶液与 2 ml蒸馏水混合后的吸光度 A0，以及2 ml测试样品溶液与1 ml无水乙醇混合后的吸光度A2，且以无水乙醇作为参比溶液。

DPPH·清除率 = 1-(A1-A2)/A0

3　结　果

3.1对O2-·的清除作用分别对EGB溶液和EGB总黄酮溶液及空白溶液进行测定，每个体系重复测定3次，取发光强度的平均值计算清除率，结果见表1。

表1所示为不同浓度的EGB和EGB黄酮对O2-·的清除作用。由表1可知，在实验浓度范围内，EGB和EGB黄酮对O2-·均具有一定的抑制作用，且清除率随浓度增大而增大，呈量效关系。但在二者总黄酮醇苷浓度相同的情况下，EGB的清除效果好于EGB黄酮。由于EGB黄酮中已经不含银杏内酯，因此，我们推测EGB中的银杏内酯在清除O2-·的过程中，可能起到了协同作用，增强了EGB黄酮清除O2-·的能力。

表1　银杏叶提取物对O2-·的清除作用

3.2对·OH 的清除作用由表2可知，在实验浓度范围内，EGB和EGB黄酮对·OH均具有一定的抑制作用，且清除率随浓度增大而增大。但对比EGB与EGB黄酮对·OH的清除能力发现：当二者总黄酮醇苷浓度相同时，EGB对·OH的清除能力高于EGB黄酮。这提示EGB中的银杏内酯在清除·OH的过程中，可能起到了协同作用。

表2　银杏叶提取物对·OH的清除作用

3.3对DPPH·的清除作用由表3可知，在实验浓度范围内，EGB和EGB黄酮对DPPH·均具有一定的抑制作用，且清除率随浓度增大而增大。当二者总黄酮醇苷浓度相同时，EGB对DPPH·的清除能力优于EGB黄酮。

表3　银杏叶提取物对DPPH·的清除作用

4　讨　论

本实验通过将银杏叶提取物与银杏叶提取物总黄酮抗氧化能力进行对比可知：二者对O2-·、·OH和DPPH·均具有一定的清除能力，且对三种自由基的清除作用呈量效关系。但当二者所含总黄酮醇苷浓度相同时，前者对三种自由基的清除能力均大于后者。

[1]LM Goh,PJ Barlow,CS Yong.Examination of antioxidant activity of Ginkgo biloba leaf infusions[J].Food Chemistry,2003，82(2): 275-378.

[2]TMA Elattar,A Svirji.The inhibitory effects of curcumin,genistein,quercetin and cisplatin on the growth of oral cancer cells in vitro[J].Anticancer Research,2000,2: 1733-1746.

[3]张伟，张焕新，施洋，等.银杏叶中黄酮类物质提取及其抗氧化活性[J].江苏农业科学,2013,41(3):230-234.

[4]L Marcocci,JJ Maguire,MT Lefaix,et al.The nitric oxide-scavenging properties of Ginkgo biloba extract EGb761[J].Biochem Biophys Res Commun,1994,201(2):7482-7512.

[5]刘彩红,王爱玲,李玉琴，等.款冬花多糖抗氧化能力测定[J].中国现代应用药学,2011,28 (10):886-889.

Comparison of the antioxidant activity between Gingko biloba extract and its total flavonoids

SONG Wei-wei LIU Fen-fen LIU Cai-hong

(College of Pharmacy,Taishan Medical University,Taian 271016,China)

Objective: To compare the antioxidant activity between Gingko biloba extract and its total flavonoids.Methods: The effects of Gingko biloba extract and its total flavonoids on O2-·,·OH and DPPH were detected by methods of flow injection chemiluminescence and ultraviolet spectrophotometry.Results: Gingko biloba extract and its total flavonoids could inhibit O2-·,·OH and DPPH effectively.The antioxidant activities of Gingko biloba extract was stronger than those of its total flavonoids when the dose of flavonoids was similar.Conclusion: Gingko biloba extract has stronger antioxidant activities than its flavonoids.

Gingko biloba extract; total flavonoids; antioxidant activities

泰安市科技发展计划(2015NS2118)，国家级大学生创新创业训练计划(201410439028)。

宋唯唯(1993—)，女，2012级制药工程本科。

刘彩红，女，主要从事中药活性成分的研究，E-mail: chliu@tsmc.edu.cn。

R965

A

1004-7115(2016)05-0484-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.05.002

2016-02-01)