FSTL1及MMP-2在子痫前期孕妇胎盘组织及滋养细胞中的表达及相关性研究*

马红柳，饶海英，漆洪波，罗　欣（.垫江县人民医院妇产科，重庆408000；.重庆医科大学附属第一医院产科，重庆40006）

FSTL1及MMP-2在子痫前期孕妇胎盘组织及滋养细胞中的表达及相关性研究*

马红柳1，饶海英2，漆洪波2，罗欣2（1.垫江县人民医院妇产科，重庆408000；2.重庆医科大学附属第一医院产科，重庆400016）

目的探讨卵泡抑素样蛋白1（FSTL1）及基质金属蛋白酶2（MMP-2）在子痫前期孕妇胎盘组织及滋养细胞中的表达及相关性。方法以2014年1月至2015年9月在重庆医科大学附属第一医院产科住院行剖宫产术的子痫前期孕妇35例和正常足月妊娠行择期剖宫产术孕妇40例为研究对象，采用蛋白质印迹法检测正常晚期妊娠孕妇和子痫前期患者胎盘组织中FSTL1和MMP-2蛋白的表达；采用免疫荧光法检测正常培养和缺氧/复氧（H/R）处理的人早孕期绒毛膜外滋养细胞株HTR8/SVneo中FSTL1和MMP-2的表达；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测两组孕妇血清FSTL1水平，分析FSTL1和MMP-2表达水平与子痫前期的相关性。结果与正常足月妊娠胎盘组织比较，子痫前期患者胎盘组织中FSTL1水平明显升高，而MMP-2水平明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与正常培养的细胞比较，H/R处理的细胞FSTL1蛋白水平明显升高，而MMP-2水平明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；FSTL1主要定位于HTR8/SV-neo细胞质中。正常足月妊娠孕妇血清FSTL1水平显著低于子痫前期孕妇，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论胎盘组织和血清中FSTL1和MMP-2水平的异常变化可能与子痫前期发病有关，二者可能存在协同作用。通过研究FSTL1和MMP-2的相互作用，可为子痫前期发病机制的研究提供新思路。

先兆子痫；胎盘；滋养层；卵泡抑素；基质金属蛋白酶2；氧化性应激；孕妇

子痫前期是一种妊娠期特发的全身性疾病，其病因和发病机制目前仍未完全阐明，严重威胁围生期母儿安全。卵泡抑素样蛋白1（follistatin-like protein 1，FSTL1）又名转化生长因子 β1诱导蛋白36（transforming growth factor-β1-stimulated clone36，TSC-36）或卵泡抑素相关蛋白（follistatinrelated protein，FRP），是细胞外基质蛋白家族成员之一［1］，其具有调控细胞增殖、分化、凋亡、侵袭、迁移等多种生物学功能［2］。近年来有文献报道，FSTL1参与了炎症、心血管疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等的发生和发展［3-4］，但其与子痫前期发病的相关性尚不清楚。本研究通过检测子痫前期孕妇胎盘组织及血清中FSTL1的表达，以及缺氧/复氧（H/R）条件下人早孕期绒毛膜外滋养细胞株HTR8/SVneo中FSTL1、基质金属蛋白酶2 （matrix metalloproteinase 2，MMP-2）的表达情况，初步探讨二者与子痫前期发病的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料以2014年1月至2015年9月在重庆医科大学附属第一医院产科住院行剖宫产术的子痫前期孕妇35例（诊断标准参照《妇产科学》第8版全国统编教材［5］，子痫前期组）和正常足月妊娠行择期剖宫产术孕妇40例（正常对照组）为研究对象。均为单胎妊娠；既往无高血压、心脏病、肾脏病、糖尿病及甲状腺功能亢进等病史；无复发性自然流产、畸胎、死胎等不良孕产史；无吸烟、长期服用药物史。要求孕期无急、慢性感染性疾病；胎儿无畸形。两组孕妇年龄、体质量指数、孕产次、孕周、新生儿性别等比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　两组孕妇一般资料比较

1.2方法

1.2.1标本采集入院后，于治疗和分娩前采集两组孕妇空腹肘静脉血5 mL，离心分离收集血清，样品转入-80℃冰箱保存待测。剖宫产孕妇胎盘娩出后5 min内，避开肉眼可见的钙化灶及坏死区，取胎盘母体面中央组织约1.0 cm3大小，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer aolution，PBS）漂洗后立即置于液氮中保存，过夜后转入-80℃冰箱保存待测。

1.2.2蛋白质印迹法检测胎盘组织及HTR8/SVneo细胞中FSTL1和MMP-2蛋白的表达严格按照蛋白质提取试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）说明书提取胎盘组织和HTR8/SVneo细胞总蛋白。采用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）法检测蛋白水平（南京凯基生物技术研究所）。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE），将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF，美国Millipore公司），室温封闭1 h后，分别加入羊抗人FSTL1单克隆抗体（1∶1 000，美国Abacm公司）、兔抗人MMP-2单克隆抗体（1∶1 000，美国Abacm公司）和兔抗人β-actin单克隆抗体（1∶1 000，美国Santa Cruz公司），4℃孵育过夜。分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1∶1 000，北京中杉金桥生物技术有限公司）和兔抗羊IgG（1∶1 000，美国Gene Tex公司）二抗，室温孵育1 h。加入电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显色液（南京凯基生物技术有限公司），利用ChemiDoc XRS化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）检测蛋白质印迹各条带灰度，用Quantity One 4.6.2版图像分析软件进行分析。

1.2.3细胞免疫荧光检测HTR8/SVneo细胞中FSTL1的表达HTR8/SVneo细胞按参考文献［6］进行正常培养（正常培养组）和H/R培养（H/R组），H/R培养方法为先缺氧培养8 h后再常氧培养16 h 2个循环，共计48 h后再行固定、1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton×100）透化、封闭后，滴加羊抗人FSTL1单克隆抗体（1∶50），置于湿盒，4℃孵育过夜。滴加异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的兔抗羊荧光二抗（1∶50，美国Earthox公司），37℃孵育1 h，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）染细胞核，甘油封片，于激光共聚焦显微镜（TCS SP2，Leica，德国）下观察着色部位及荧光强度。

1.2.4孕妇血清中FSTL1水平检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测两组孕妇外周血FSTL1水平。FSTL1 ELISA检测试剂盒购自上海润裕生物科技有限公司，操作按说明书进行。所有标本均行3个复孔检测且为同批测定，取平均值为最终检测水平，批内变异系数（coefficient variations，CV）＜0.5%。

1.3统计学处理应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1两组孕妇胎盘组织中FSTL1和MMP-2蛋白的表达子痫前期组孕妇胎盘组织中FSTL1蛋白表达水平较正常对照组明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1　两组孕妇胎盘组织中FSTL1和MMP-2蛋白的表达

2.2HTR8/SVneo细胞中FSTL1和MMP-2蛋白的表达H/R组HTR8/SVneo细胞FSTL1蛋白表达水平较正常培养组明显升高，而MMP-2表达水平较正常培养组降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2　HTR8/SVneo细胞中FSTL1和MMP-2蛋白的表达

2.3FSTL1在HTR8/SVneo细胞中的表达定位FITC标记的荧光二抗结合FSTL1蛋白呈绿色荧光；DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光。通过两组图片的合并（Merged）显示，FSTL1主要表达在细胞质中，H/R组荧光强度较正常培养组增强。见图3。

图3　FSTL1蛋白在HTR8/SVneo细胞中的表达定位（200×）

2.4两组孕妇血清FSTL1水平比较子痫前期组孕妇血清FSTL1水平显著高于正常对照组［分别为（5.21±0.92）、（8.18±0.67）μg/mL］，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3　讨　论

FSTL1属于细胞外基质蛋白家族，存在于大部分哺乳动物中，可由多种细胞分泌。FSTL1具有多种生理功能，参与多种生物学过程，包括细胞迁移、增殖、凋亡、新陈代谢、分化、免疫反应及内分泌功能等［1，7］。有研究表明，FSTL1可能与肿瘤细胞转移和浸润有关［8］。Chan等［9］应用PCR检测了45例子宫内膜癌及16例卵巢癌患者癌组织中FSTL1的表达，结果发现，与正常对照组织比较，FSTL1的表达是下调的。将FSTL1过表达慢病毒转染入内膜癌细胞及卵巢癌细胞，发现肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力减弱。而有关FSTL1在人类胎盘组织中的表达情况的研究较少。Mouillet等［10］通过PCR、蛋白质印迹等方法证实FSTL1在人类胎盘组织绒毛外滋养细胞中特异性表达。

MMPs是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质的酶，其异常表达可导致一些病理过程的发生。MMPs与肿瘤细胞转移和侵袭能力密切相关。以往研究已证实，MMPs的异常表达与子痫前期存在密切关系［11］。滋养细胞侵袭的关键在于对基质成分的水解及基底膜的穿越，而基底膜的主要成分包括Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、硫酸类肝素蛋白多糖等，这些均是MMPs的作用底物。由此可见，MMPs在这一过程中起着关键作用。

本研究发现，FSTL1主要表达在胎盘的滋养细胞中，子痫前期患者胎盘组织中FSTL1表达水平较正常胎盘组织显著升高，且子痫患者血清FSTL1水平也高于正常孕妇，证实其表达异常与子痫前期具有相关性，且可能与滋养细胞的侵袭能力有关。而Chaly等［3］研究证实，通过H/R培养HTR8/SVneo细胞可以诱发显著的氧化应激，与子痫前期胎盘组织类似。本研究利用该模型证实，H/R组HTR8/SVneo细胞FSTL1蛋白表达水平显著高于正常培养组，表明氧化应激可以触发FSTL1在滋养细胞中的异常表达，与前文所述子痫前期中FSTL1表达升高相呼应。本研究进一步证明，在子痫前期胎盘和H/R处理的 HTR8/SVeno细胞中MMP-2活性下降。FSTL1蛋白可通过抑制MMP的表达抑制肿瘤细胞的转移和浸润，表明在子痫前期中由于氧化应激刺激FSTL1的表达，抑制了MMP-2的活性，从而引起滋养细胞侵袭能力下降。

子痫前期的发生是一个多因素、分阶段的动态进展过程，而滋养细胞的侵袭能力受损在此过程中发挥着举足轻重的作用。本研究通过检测子痫前期及正常足月妊娠者胎盘组织和血清中FSTL1及MMP-2在胎盘组织中的表达，并通过采用H/R滋养细胞模型模拟子痫前期，进一步证实了目的蛋白在氧化应激下的异常表达情况，初步探讨了FSTL1和MMP-2在子痫前期发病中的作用，期望能为子痫前期的发病机制研究提供新的靶点和理论依据。

［1］Wei K，Serpooshan V，Hurtado C，et al.Epicardial FSTL1 reconstitution regenerates the adult mammalian heart［J］.Nature，2015，525（7570）：479-485.

［2］Hayakawa S，Ohashi K，Shibata R，et al.Cardiac myocyte-derived follistatin-like 1 prevents renal injury in a subtotal nephrectomy model［J］.J Am Soc Nephrol，2015，26（3）：636-646.

［3］Chaly Y，Hostager B，Smith S，et al.Follistatin-like protein 1 and its role in inflammation and inflammatory diseases［J］.Immunol Res，2014，59（1/3）：266-272.

［4］Kudo-Saito C，Fuwa T，Murakami K，et al.Targeting FSTL1 prevents tumor bone metastasis and consequent immune dysfunction［J］.Cancer Res，2013，73（20）：6185-6193.

［5］谢幸，苟文丽.妇产科学［M］.8版.北京：人民卫生出版社，2013：67.

［6］Luo X，Yao ZW，Qi HB，et al.Gadd45α as an upstream signaling molecule of p38 MAPK triggers oxidative stress-induced sFlt-1 and sEng upregulation in preeclampsia［J］.Cell Tissue Res，2011，344（3）：551-565.

［7］Fan N，Sun H，Wang Y，et al.Follistatin-like 1：a potential mediator of inflammation in obesity［J］.Mediators Inflamm，2013，2013：752519.

［8］Chen SX，Xu XE，Wang XQ，et al.Identification of colonic fibroblast secretomes reveals secretory factors regulating colon cancer cell proliferation［J］.J Proteomics，2014，110：155-171.

［9］Chan QK，Ngan HY，Ip PP，et al.Tumor suppressor effect of follistatinlike 1 in ovarian and endometrial carcinogenesis：a differential expression and functional analysis［J］.Carcinogenesis，2009，30（1）：112-114.

［10］Mouillet JF，Mishima T，Paffaro AM，et al.The expression and post-transcriptional regulation of FSTL1 transcripts in placental trophoblasts［J］. Placenta，2015，36（11）：1231-1238.

［11］Vincent ZL，Mitchell MD，Ponnampalam AP.Regulation of MT1-MMP/ MMP-2/TIMP-2 axis in human placenta［J］.J Inflamm Res，2015，8：193-200.

Study on expression and correlation of FSTL1 and MMP-2 in placenta tissue and trophoblasts in preeclampsia pregnant women*

Ma Hongliu1，Rao Haiying2，Qi Hongbo2，Luo Xin2（1.Department of Gynecology and Obstetrics，Dianjiang County People′s Hospital，Chongqing 408000，China；2.Department of Obstetrics，First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo detect the expression and correlation of follistatin-like protein 1（FSTL1）and matrix metalloproteinase-2（MMP-2）in placenta tissue and trophoblasts in preeclampsia pregnant women.MethodsThirty-five preeclampsia pregnant women and 40 normal full term pregnant women undergoing cesarean section in the obstetric department of the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University from January 2014 to September 2015 were taken as the research subjects. Western blotting was adopted to detect the expression of FSTL1 and MMP-2 protein in placental tissues；the expressions of FSTL1 and MMP-2 in human early pregnancy extrachorionic trophoblastic cell lines HTR8/SVneo by normal culture and hypoxia/re-oxygenation（H/R）treatment were detected by adopting immunofluorescence assay；the enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to examine the levels of FSTL1 in serum in the two groups.The correlation between FSTL1 and MMP-2 expression levels with preeclampsia was analyzed.ResultsThe expression level of FSTL1 in placenta tissues of preeclampsia patients was significantly increased compared with placenta tissue in full term pregnancy，while the expression level of MMP-2 was significantly reduced，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.The expression level of FSTL1 protein in the cells of H/R treatment was significantly increased compared with that in the normal culture group，while the expression level of MMP-2 was significantly reduced，and the differences were statistically significant（P＜0.05）；the positioning of FSTL1 was primarily located in cytoplasm of HTR8/SVneo.The serum FSTL1 level in the full term pregnant women group was significantly lower than that in the preeclampsia pregnant women，the difference was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionThe abnormal changes of FSTL1 and MMP-2 expression in placental tissues and serum may contribute to the pathogenesis of preeclampsia，the two may have synergistic effect. Studying the interaction of FSTL1 and MMP-2 may provide a new idea for the research of preeclampsia pathogenesis.

Pre-eclampsia；Placenta；Trophoblasts；Follistatin；Matrix metalloproteinase 2；Oxidative stress；Pregnant women

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.005

A

1009-5519（2016）13-1967-03

国家自然科学基金资助项目（81300509、81471472）。

马红柳（1974-），主治医师，主要从事妇产科常见病及多发病临床诊疗工作。

（2016-03-11）