阿米洛利预处理对浸水束缚大鼠血清NO及胃黏膜MPO的影响*

蒋　群，屠伟峰，徐少群，赵高峰（.广东省中医院麻醉科，广州5000；2.广州军区广州总医院临床麻醉中心，广东广州5000）

阿米洛利预处理对浸水束缚大鼠血清NO及胃黏膜MPO的影响*

蒋群1，屠伟峰2△，徐少群1，赵高峰1（1.广东省中医院麻醉科，广州510010；2.广州军区广州总医院临床麻醉中心，广东广州510010）

目的观察酸敏感离子通道阻断剂——阿米洛利（Amiloride）预处理对急性胃黏膜病变（AMGL）大鼠的影响，并探讨AMGL发病机制与酸敏感离子通道（ASICs）的关系。方法选取Wistar大鼠30只，分为正常空白对照组（NC组）、应激模型组（WS组）、阻断剂组（AM组，给予Amiloride预处理），每组10只。采用浸水束缚应激（WIRS）方法复制AMGL模型，于应激6 h后观察胃黏膜大体及光镜下胃黏膜损伤程度、组织学改变及溃疡指数（UI）、血清一氧化碳（NO）活性和胃黏膜组织髓过氧化物酶（MPO）水平。结果WS组大鼠胃黏膜呈暗红色，有大量点状出血、线状出血或片状糜烂，黏膜下血管和皮区血管充血，光镜下见上皮细胞黏液层变薄、缺失，细胞间隙变大，不同程度坏死；AM组大鼠WIRS 6 h后大鼠胃黏膜出血或糜烂程度明显轻于WS组，光镜下虽可见大量毛细血管充血、扩张，上皮细胞黏膜层有少许缺损，但基本完整。与NC组比较，WS组大鼠WIRS 6 h后胃黏膜UI显著增高，血清NO活性增强，胃组织MPO水平明显增高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与WS组比较，AM组大鼠胃黏膜UI、血清NO活性及胃组织MPO水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论Amiloride可有效减轻炎症介导的WIRS大鼠急性胃黏膜损伤或病变，提示ASICs可能参与了WIRS大鼠AMGL的发生。

阿米洛利；胃疾病；急性病；一氧化氮；胃黏膜；过氧化物酶；离子通道；大鼠

急性胃黏膜病变（AMGL）又称为应激性胃溃疡，指在各种应激状态下，胃、十二指肠发生的急性、多发性黏膜浅表糜烂和溃疡。大量研究表明，胃肠道pH值下降是许多病理生理过程的标志。休克、脓毒症等各种病理条件下内脏血流灌注不足可导致胃肠道酸中毒，而适当的酸敏感具有维持胃肠道内环境稳定的作用，不适当的酸敏感可能加速炎症和黏膜溃疡的发生［1］。酸敏感离子通道（ASICs）作为化学感受器、伤害感受器、机械感受器在胃肠道信息处理过程中起重要作用。作者前期研究发现，酸敏感离子通道蛋白3（ASIC3）在胸段背根神经节（DRG）神经元上广泛表达，且ASIC3 mRNA在AMGL大鼠胃投射DRG的表达量明显增高［2］，推测ASICs可能在应激性AGML的发生、发展中具有重要作用。本研究采用前期工作中应用的浸水束缚应激（WIRS）方法复制AMGL模型［2］，探讨ASICs非特异性阻断剂——阿米洛利（Amiloride）预处理对WIRS大鼠胃黏膜损伤的影响，进一步了解ASICs在AMGL发生中的作用。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物采用成年雄性无特定病原体级（SPF级）Wistar大鼠30只，体质量（200±30）g，由南方医科大学动物中心提供。

1.1.2试剂与仪器Amiloride粉剂（美国Sigma公司，批号不详），髓过氧化物酶（MPO）试剂盒和一氧化氮（NO）试剂盒由南京建成生物医学工程研究所提供。紫外分光光度计Optizen 2120UV购自韩国美卡希斯公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，DK-S22型电热恒温水浴锅购自上海精宏公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型复制将30只大鼠分为正常空白对照组（NC组）、应激模型组（WS组）和阻断剂组（AM组），每组10只。NC组不给予任何处理，WS组采用WIRS法复制模型，AM组给予Amiloride预处理，即腹腔注射5μg/kgAmiloride 5min后浸水束缚。模型复制过程参照以往制作方法［2］：乙醚麻醉后，将大鼠四肢固定在自制的铁丝网上，待大鼠清醒后垂直放入（20±1）℃水中，水面至胸骨剑突，6h后取出。

1.2.2标本采集与观察WIRS 6 h后，在水合氯醛深度麻醉状态下取胃，沿胃大弯剪开平铺，用冷生理盐水冲洗，在10倍解剖显微镜下观察胃黏膜情况。

1.2.3胃黏膜溃疡指数（UI）的判定按Guth等［3］标准评估胃黏膜UI：点状出血为1分，糜烂小于1 cm为2分，糜烂1～2 cm为3分，糜烂大于2～3 cm为4分，糜烂大于3 cm为5分；宽度大于2 mm者分值×2。所有得分相加即为UI。

1.2.4胃黏膜组织学检查在胃黏膜损伤明显处用组织剪剪取0.5 cm×1.0 cm大小组织块，置于10%甲醛溶液中固定24～48 h，石蜡包埋后行4 μm切片，再用苏木精-伊红（HE）染色后于40倍光镜下观察胃黏膜组织学变化。

1.2.5血清NO活性测定腹主动脉取血2 mL，分离血浆，取上清液保存于-70℃冰箱中备用，采用硝酸还原酶法比色测定。具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6胃黏膜MPO测定取胃组织液氮保存备用。用液氮研磨组织，与生理盐水按体积质量比19∶1制作5%组织匀浆。采用比色法测定，具体方法与步骤参照试剂盒说明书进行。

1.3统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，实验数据以±s表示，组间样本均数比较采用oneway ANOVA检验，组间两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1Amiloride对AMGL大鼠胃黏膜大体形态的影响

经大体标本观察，NC组大鼠胃腔有淡黄色透明液体，胃黏膜呈淡红色，光滑完整，无充血；WS组大鼠WIRS 6 h后胃腔内见大量血性积液，黏膜表面大量暗红色血痂，充血严重，呈点状、线状、片状糜烂坏死；AM组大鼠胃腔液体呈黄色，胃黏膜仍存在充血、水肿、岀血、坏死，但程度较轻，颜色较淡（图1）。

2.2Amiloride对AMGL大鼠胃黏膜组织形态的影响光镜下观察NC组大鼠胃黏膜上皮光滑完整，腺体排列整齐；WS组大鼠胃黏膜上皮黏膜坏死、脱落，细胞间隙变大，毛细血管严重充血、扩张，间质炎症细胞浸润，腺体破坏严重；AM组大鼠胃黏膜上皮部分坏死，腺体破坏轻，毛细血管轻度充血、扩张，损伤明显轻于WS组（图2）。

图2　Amiloride对AMGL大鼠胃黏膜组织病理学的影响（HE染色，40×）

2.3Amiloride对AMGL大鼠胃黏膜UI、血清NO活性和胃组织MPO水平的影响与NC组比较，WIRS 6 h后，WS组大鼠胃黏膜UI显著增高，血清NO活性增强，胃组织MPO水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与WS组比较，AM组大鼠胃黏膜UI、血清NO活性及胃组织MPO水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。胃黏膜UI与MPO水平呈显著正相关（r=0.904，P＜0.01）。

表1　各组大鼠胃黏膜UI、血清NO活性和胃组织MPO水平比较（±s）

表1　各组大鼠胃黏膜UI、血清NO活性和胃组织MPO水平比较（±s）

注：-表示无此项。

组别N C 组W S 组A M 组n　U I（分）　N O （μ m o l / L）　M P O （U / g湿重）1 0 1 0 1 0 F P --0 . 0 0 ± 0 . 0 0 4 8 . 7 2 ± 3 . 1 2 2 1 . 7 0 ± 5 . 7 3 2 3 5 . 3 7 ＜0 . 0 1 1 3 . 4 5 ± 2 . 4 6 2 8 . 9 5 ± 2 . 7 5 1 8 . 0 3 ± 3 . 0 6 2 5 . 4 7 ＜0 . 0 1 1 3 . 3 9 ± 4 . 1 2 3 1 . 9 1 ± 2 . 3 5 1 6 . 2 4 ± 2 . 7 3 2 8 . 2 3 ＜0 . 0 1

3　讨　论

机体在遭受各种创伤、重病及其他应激情况时，这些非特异性的强烈刺激可使机体各系统本能地出现功能和结构上的剧烈反应。胃是应激状态下最为敏感的器官之一，此时胃黏膜所表现的急性病变也称为应激性胃溃疡，其发生机制尚未明确，目前认为是维持胃黏膜完整性的平衡因子失调和破坏，其病因主要集中在胃黏膜微循环障碍、胃酸反弥散、氧自由基损害、细胞凋亡等方面。本研究采用WIRS复制应激性胃溃疡模型。

ASICs属于对Amiloride敏感的上皮钠通道/退化蛋白（ENaC/DEG）通道家族［4］，由6个不同的亚基组成，ASICs作为化学感受器、伤害感受器和机械感受器，在胃肠道信息处理过程中具有重要作用［5］。有研究表明，ASIC3和瞬时受体电位离子通道（TRPV1，俗称辣椒素受体）共同表达于脊髓DRG神经元［6］，在胃肠道高炎性反应中，对感受组织酸化起到伤害性感受器的重要作用。同时，已有大量研究表明，胃酸刺激能活化DRG神经元轴突上的TRPV1受体，TRPV1受体活化导致降钙素基因相关肽（GCRP）、神经肽A（NKA）等肽类物质大量释放，通过GCRP/NO/前列腺素（PGS）途径诱导充血反应［7］，增加胃黏膜血流量（GMBF），对胃黏膜起到保护作用。作者在前期工作中也发现，在WIRS大鼠胸段胃投射DRG中TRPV1水平升高，胃黏膜中GCRP水平增加，提示胃黏膜的传出样作用［8］。也有研究明确显示，在胃黏膜感受器传入系统与NO胃黏膜保护机制中扮演了重要角色［9］。而在ASIC3去基因小鼠中［10］，由氯化氢诱导的胃黏膜损伤程度更大一些，由此推测，ASIC3与胃黏膜保护相关，其保护机制与TRPV1相似。本研究通过使用ASICs阻断剂——Amiloride预处理，观察ASICs在WIRS大鼠胃黏膜损伤发生中的作用。

本研究结果显示，正常大鼠胃黏膜呈淡红色，光滑完整，无充血；WIRS 6 h后大鼠胃腔内见大量血性积液，胃黏膜明显充血、水肿，损伤严重，呈点线状甚至片状糜烂、坏死，UI高达（48.72±3.12）分，而Amiloride预处理大鼠WIRS 6 h后，大鼠胃黏膜出血或糜烂程度明显轻于WS组，UI降低［（21.70±5.73）分］。光镜下观察WIRS 6 h后大鼠胃黏膜、上皮黏膜坏死、脱落，细胞间隙变大，毛细血管严重充血、扩张，间质炎性细胞浸润，腺体破坏严重；Amiloride预处理大鼠WIRS 6 h后胃黏膜损伤程度明显减轻，仅有部分毛细血管充血、扩张。表明在Amiloride阻断ASICs的情况下，WIRS模型大鼠胃黏膜损伤明显减轻，即Amiloride预处理对大鼠AMGL具有明显保护作用。由此推测，ASICs可能参与了AMGL的发生。

本研究结果表明，WS组在胃溃疡发生时伴随着UI的增加和NO活性升高，与NC组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），提示在应激状态下机体能产生适量的NO增加GMBF，保护局部胃黏膜，而在Amiloride阻断ASIC3的作用下，WIRS 6 h后NO活性无明显增强，说明ASIC3同样可以感受胃酸刺激，诱发胃黏膜适应性保护作用［11］。另外，本研究结果显示，WS组大鼠UI，胃黏膜组织MPO水平较NC组显著增高，且UI与MPO水平呈显著正相关，与前期研究结果一致［12］；而Amiloride阻断后MPO水平降低，提示阻断ASIC3可以通过抑制中性粒细胞活化而产生胃黏膜保护作用。

本研究提示，ASICs在胃肠道病变中具有“双刃剑”的作用，小剂量的酸敏感可以诱发胃黏膜的适应性保护作用；同时，ASIC3在胃肠道高炎性反应中感受组织酸化，起到伤害性感受器作用。推测ASICs参与AMGL的具体机制可能是由于WIRS诱导产生的胃溃疡加重了ASIC3对酸诱发痛的感知，并通过炎症介导加重了应激对胃黏膜的损伤，阻断或去除这种酸感受器可改善胃肠道的酸伤害性感受，减轻炎性反应，从而发挥胃黏膜的保护作用。

综上所述，ASICs在维持胃肠道内环境的稳定中具有重要作用，激活ASICs可以通过增加GMBF发挥适应性保护作用，同时，还可通过活化中性粒细胞加重胃黏膜损伤，但其具体机制尚需进一步研究。

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Effect of amiloride pretreatment on serum NO and gastric mucosal MPO in water immersion restraint rats*

Jiang Qun1，Tu Weifeng2△，Xu Shaoqun1，Zhao Gaofeng1（1.Department of Anesthesiology，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510010，China；2.Clinical Anesthesia Center，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region，Guangzhou，Guangdong 510010，China）

ObjectiveTo investigate the effect of acid sensing ion channels（ASICs）blocker amiloride precondition on acute gastricmucosallesion（AGML）ratandto studythe relationbetweenAGMLpathogenesiswith ASICs.MethodsThirty Wistar rats were selected and randomly divided to 3 groups（10 cases per group），including the normal blank control group（NC），stress model group（WS）and blocker group（amiloride precondition group，AM）.The AGML model was induced by water immersion restraint stress（WIRS）.The gastric tissues in general，gastric mucosal lesion degree，histological change under microscope and ulcer index were observed，the levels of serum NO and MPO in gastric mucosal tissue were observed at 6 h after stress.ResultsThe gastric mucosa in the WS group showed dark red with a large of punctate hemorrhage，linear hemorrhage or flake erosion，the submucosal blood vessel and dermatomal blood vessel were congested，the epithelial cell mucous layer was thin and deleted，the intracellular space was increased with different degrees of necrosis；but the gastric mucosal hemorrhage or erosion degree after 6 h of WIRS in the AM group was obviously improved compared with that in the WS group；a large number of blood capillary congestion and expansion were seen under microscope，the epithelial cell mucosal layer had a little defects，but was basically intact.Compared with the group NC，the gastric mucosal UI after 6 h of WIRS in the WS group was significantly increased，serum NO enhanced and gastric tissue MPO level was significantly elevated，the differences were statistically significant（P＜0.01）；compared with the WS group，gastric mucosal UI，serum NO level and gastric tissue MPO level were significantly decreased，the differences were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionAmiloride can effectively alleviate the WIRS rat acute gastric mucosal lesion mediated by inflammation，which prompting that ASICs may participate in the occurrence of AGML in WIRS rat.

Amiloride；Stomach diseases；Acute disease；Nitric oxide；Gastric mucosa；Peroxidase；Ion channels；Rats

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.003

A

1009-5519（2016）13-1961-03

国家自然科学基金资助项目（81272141）；广东省自然科学基金资助项目（S2011010003373）；江苏省教育厅开放研究课题（KJS09002）。

蒋群（1984-），硕士研究生，主要从事胃保护与伤害性感受器关系的研究。

△，E-mail：wftuyx02@163.com。

（2016-03-18）