牙龈缺损修复中钙结合蛋白和胶原酶-1的浓度变化*

董露，杨琴秋，肖琼，尹晓桦，陈红亮，孙勇△（.凉山彝族自治州第一人民医院口腔科，四川西昌65000；.遂宁市第一人民医院口腔科，四川69000；.重庆拜博口腔医院管理有限公司九龙坡口腔医院，重庆0005；.中国人民解放军成都军区机关医院口腔科，四川成都600）

·论著·

牙龈缺损修复中钙结合蛋白和胶原酶-1的浓度变化*

董露1，杨琴秋2，肖琼3，尹晓桦1，陈红亮4，孙勇4△
（1.凉山彝族自治州第一人民医院口腔科，四川西昌615000；2.遂宁市第一人民医院口腔科，四川629000；3.重庆拜博口腔医院管理有限公司九龙坡口腔医院，重庆400051；4.中国人民解放军成都军区机关医院口腔科，四川成都610041）

目的检测富血小板纤维蛋白（PRF）膜与胶原膜修复拔牙术后牙龈缺损各时间节点的分泌物中钙结合蛋白和胶原酶-1的水平，评价PRF对牙龈缺损的修复和调节局部炎性反应的能力。方法选取2013年8月至2014年12月到成都军区机关医院种植修复临床专科中心就诊，需拔除磨牙并同期进行位点保存的患牙16例，随机分为PRF膜组和胶原膜组，各8例。拔牙后，牙槽窝内植入Bio-Oss骨替代材料，表面分别覆盖PRF膜或胶原膜。通过ELISA检测术区在术后3、7、14、21、28 d创面分泌物中胶原酶-1和钙结合蛋白的水平，动态评价PRF对牙龈缺损的修复和调节局部炎性反应的能力。结果钙结合蛋白水平在术后3、7 d胶原膜组均明显高于PRF膜组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；术后14、21、28 d胶原膜组稍高于PRF膜组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。胶原酶-1水平在术后3、7 d PRF膜组均明显高于胶原膜组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；术后14、21、28 d PRF组稍高于胶原膜组，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 PRF能促进牙龈缺损的修复，减轻术区局部炎性反应。PRF膜是一种有一定抗感染能力的生物活性再生平台材料，有一定的临床价值。

牙龈疾病；钙结合蛋白质类；富血小板纤维蛋白；胶原酶类；牙修复体；口腔

【Abstract】Objective To detect the levelsof calbindin and collagenase-1 in the secretion atvarious time nodes of gingivalde fectafter teeth extraction operation by the platelet-rich fibrin（PRF）membrane and collagen membrane，and to evaluate the ability of PRFon repairing the gingival defectand regulating the local inflammatory reaction.Methods Sixteen teeth needing to extractpremolar teeth ormolarand simultaneously conducting the site preservation in the Special Dental Implantation and Repair ClinicalCenterof the Chengdu Military Region from August 2013 to December 2014 were selected and divided into the PRF group and collagen membrane group，8 cases in each group.Afterextracting teeth，the tooth socketin the two groups was implanted by the bone substitutematerials（Bio-Oss）and the surface was respectively covered by the PRF membrane and the collagen membrane. ELISA was used to detect the collagenase-1 and calbindin levels in the wound secretion on postoperative 3，7，14，21，28 d.The ability of PRF on the repair of gingival detection and regulation of local in flammatory reaction was dynamically evaluated.Results

The calbindin levelon postoperative 3，7 d in the collagen membrane group was higher than that in the PRF membrane group，and the difference was statistically significant（P＜0.05），the calbindin levelon postoperative 14，21，28 d in the collagen membrane group was slightly higher than that in the PRF membrane group，but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.The collagenase-1 levelon postoperative 3，7 d in the PRF membrane group was significantly higher than that in the collagen membrane group，there are statistically significant difference（P＜0.05），which on 14，21，28 d in the PRF membrane group was slightly higher than that in the collagen membrane group，the difference was notstatistically significant（P＞0.05）.Conclusion PRF membrane can promote the repair of gingival defectand decrease local in flammatory reaction.PRF membrane is a biological activity regeneration platform material with some anti-infection ability and hasa certain clinicalvalue.

【Key words】Gingivaldiseases；Calcium-bindingproteins；Platelet-rich-fibrin；Collagenases；Dental prosthesis；Mouth

牙龈缺损的修复是由多种细胞、细胞因子参与调控的一个复杂过程，其中起到重要作用的蛋白有钙结合蛋白（calbindin）和胶原酶-1（collagenase-1）。钙结合蛋白在口腔炎症疾病患者的唾液、龈沟液和局部组织中高水平表达［1］；而胶原酶-1通过降解细胞外基质成分从而实现新生血管的形成，促进软组织愈合［2］。本研究通过收集患牙拔除后行位点保存术患者术区术后牙龈软组织缺损创面分泌物，检测其中钙结合蛋白和胶原酶-1的水平，分析探讨富血小板纤维蛋白（PRF）膜促进牙龈缺损修复和减轻炎性反应的能力。

1　资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料选取2013年8月至2014年12月到成都军区机关医院种植修复临床专科中心就诊，因各种原因需要拔除磨牙并同期进行位点保存的患牙16例，共16颗磨牙。按就诊顺序，采用随机数字化表分为PRF膜组和胶原膜组，各8例。

1.1.2纳入标准拔牙后牙龈软组织缺损面积大于或等于5mm×5mm；拔牙位点及周围软组织无炎症；邻牙无炎症，松动度小于Ⅰ度；全身健康；血小板计数（100～300）×109L-1，采血前3个月未服用过影响血液中血小板功能的药物；未服用影响牙龈愈合的药物，如抗癫痫药物、免疫抑制剂等。

1.1.3材料与试剂Bio-Oss骨替代材料（Geistlich Pharma AG，瑞士），海奥口腔修复膜（正海生物技术有限公司，烟台），1.5mL EP管（Axygen公司，美国），3M滤纸（Whatman，英国），人胶原酶-1 ELISA试剂盒（Abcam公司，美国），人钙结合蛋白ELISA试剂盒（Abcam公司，美国）等。

1.2方法

1.2.1位点保存术多根牙术前半小时分牙，常规消毒，铺巾，微创拔除患牙，刮尽术区肉芽组织，给予甲硝唑及生理盐水交替冲洗，窝洞内植入Bio-Oss骨替代材料，平齐于牙槽嵴顶，其后根据不同组别表面分别覆盖海奥胶原膜（胶原膜组）或PRF膜（PRF膜组），严密缝合。所有手术均由同一医生完成。

1.2.2PRF的制备拔牙前5min采用一次性采血针采集患者肘静脉血9mL置于无抗凝剂的真空采血管，立即放入PRF离心机中，以2 700 r/min离心12min后，得到介于顶部少细胞质液层和底部红细胞层间的PRF凝胶层，在超净工作台里弃上清液取出PRF凝胶，修剪过多的红细胞层，将PRF置于PRF成型处理工具盒中制备成膜，并置于挤压过程中的渗出液中待用［3］。

1.2.3创面分泌物的采集、保存、检测方法将3M滤纸条剪为2mm×8mm的滤纸条，5根滤纸条放入1个EP管中，编号、消毒、烘干备用。去除术区的食物残渣，棉球隔湿，三用枪轻轻将创面吹干后，将5根滤纸条轻轻插入创面边缘，遇到阻力后停止，留置1min后取出滤纸条放入EP管中，丢弃血液和唾液污染的样本。将样本立刻放入-80℃的冰箱中保存。采用ELISA测定样品中人钙结合蛋白和胶原酶-1的水平。

1.3统计学处理应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，对两组资料进行正态分布检验，均满足正态分布，计量资料以±s表示，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组术后不同时间创面分泌物中钙结合蛋白水平比较两组在术后3、7 d创面分泌物中钙结合蛋白水平均明显高于基准线［（503.47±18.23）μg/mL］，14、21、28 d时两组分泌物中钙结合蛋白水平与基准线相差不大。术后3、7 d时胶原膜组钙结合蛋白水平均高于PRF膜组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；术后14、21、28 d胶原膜组均稍高于PRF膜组，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　两组术后不同时间创面分泌物中钙结合蛋白水平比较（±s，μg/mL）

表1　两组术后不同时间创面分泌物中钙结合蛋白水平比较（±s，μg/mL）

注：与PRF组同一时间点比较，aP＜0.05。

组别PRF膜组胶原膜组术后3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 460.71±20.84 481.82±20.22 n 8 8 598.47±28.24 694.39±67.51a522.47±17.25 629.35±56.73a486.46±17.29 530.01±33.61 513.00±43.31 553.63±36.46

2．2两组术后不同时间创面分泌物中胶原酶-1水平比较术后3～28 d两组创面分泌物中胶原酶-1水平均高于基准线［（29.13±3.57）μg/mL］。在术后3、7 d PRF膜组的胶原酶-1水平均明显高于胶原膜组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；术后14、21、28 d PRF膜组均稍高于胶原膜组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　两组术后不同时间创面分泌物中胶原酶-1水平比较（±s，μg/mL）

表2　两组术后不同时间创面分泌物中胶原酶-1水平比较（±s，μg/mL）

注：与PRF组同一时间点比较，aP＜0.05。

组别PRF膜组胶原膜组术后3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 33.45±2.33 31.47±1.88 n 8 8 39.83±2.90 34.94±1.7a46.02±5.23 38.80±1.32a40.15±2.58 38.02±1.76 36.63±2.22 35.27±0.82

3　讨论

牙龈软组织缺损导致术区不能有效关闭，临床上常采用颊侧滑行粘骨膜瓣、游离粘骨膜瓣移植、覆盖胶原生物膜等方法，但是这些方法增加患者痛苦、费用较高、存在免疫原性风险等；严重影响拔牙后即刻种植手术、拔牙位点保存术的效果。因此，寻找一种方便、经济、快速具有引导牙龈软组织再生的材料迫在眉睫。

钙结合蛋白存在于粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞中，其为胞浆蛋白，创伤早期适量的钙结合蛋白可促进伤口的愈合，在创伤修复后期过度地产生钙结合蛋白将延缓创面的愈合时间［2］。损伤后牙龈上皮的基底层角质细胞增殖并快速释放胶原酶-1，并在愈合期间持续释放，胶原酶-1通过降解细胞外基质成分实现新生血管的形成，上皮细胞的有效迁移。因此，胶原酶-1水平可代表牙龈创伤处角质细胞增殖分化的能力。创面渗出液是损伤后创面愈合所处的一个微环境，急性创面的渗出液可以促进细胞增殖和创面的愈合，通过对渗出液成分含量的检测可以反映创面的愈合情况［4］。

法国学者Dohan等［5］首次发现PRF并将其成功用于口腔颌面外科手术后许多学者掀起了对PRF修复软组织的研究热潮。研究发现PRF中血小板浓度比正常值高3～7倍，白细胞浓度比正常值高2～4倍［6］。PRF中血小板α-颗粒能释放多种生长因子如血小板衍生生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子等，这些生长因子协同促进软组织愈合［7-8］；另外，PRF中三维立体网状结构中含有大量的白细胞，可释放高浓度促炎性细胞因子及抗炎性细胞因子，具有维持免疫平衡的作用［9-10］。本研究结果显示，术后3、7 d PRF膜组钙结合蛋白水平低于胶原膜组，而胶原酶-1水平却相反，差异均有统计学意义（P＜0.05），但在其余时间节点比较，两组差异无统计学意义（P＞0.05），提示术后3、7 d PRF促进牙龈软组织生长和减轻炎症的能力强于胶原膜。孙洁［11］在拔牙位点保存术中将PRF覆盖于骨替代材料表面（试验组），术后1周试验组伤口愈合良好，但对照组（骨替代材料表面覆盖胶原膜）牙龈组织色泽偏红，与本研究结果一致。

目前关于PRF的超微结构、组成成分、体外诱导细胞增殖分化的能力、促进骨组织修复再生效果报道较多；而PRF促进牙龈软组织缺损的修复再生主要集中在细胞水平［12-13］。本研究初步说明PRF膜是一种具有引导牙龈软组织再生能力，避免生物安全性风险且具有一定抗感染能力的生物活性再生平台材料，具有一定的临床指导意义。

［1］贾洪诚，冯延民.钙卫蛋白及其与口腔炎性疾病的关系［J］.国外医学，2004，31（4）：268-269.

［2］Kerkhoff C，Voss A，Scholzen TE，et al.Novel insights into the role of S100A8/A9 in skin biology［J］.Exp Dermatol，2012，21（11）：822-826.

［3］安然，孙迎春，高平.富白细胞血小板纤维蛋白与富血小板血浆对比［J］.河北医药，2013，35（20）：3148-3150.

［4］吕小星.V.A.C对创周水肿及创面微环境影响的实验研究［D］.西安：中国人民解放军第四军医大学，2003.

［5］Dohan DM，Choukroun J，Diss A，etal.Platelet-rich fibrin（PRF）：a secondgeneration plateletconcentrate.PartⅠ：technologicalconceptsand evolution［J］.Oral Surg OralMed Oral PatholOralRadiol Endod，2006，101（3）：e37-44.

［6］Everts PA，Brown Mahoney C，Hoffmann JJ，et al.Platelet-rich plasma preparation using three devices：implications for platelet activation and plateletgrowth factor release［J］.Growth Factors，2006，24（3）：165-171.

［7］Dohan DM，Choukroun J，Diss A，etal.Platelet-rich fibrin（PRF）：a second-generation platelet concentrate.PartⅡ：platelet-related biologic features［J］.Oral SurgOralMed Oral PatholOralRadiol Endod，2006，101（3）：e45-50.

［8］Choukroun J，Diss A，Simonpieri A，et al.Platelet-rich fibrin（PRF）：a second-generation platelet concentrate.PartⅣ：clinical effects on tissue healing［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e56-60.

［9］王庆福.富血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞释放炎性细胞因子的影响［D］.长春：吉林大学，2011.

［10］何赤东，刘丽忠.富血小板纤维蛋白在促进软组织损伤愈合中的临床研究进展［J］.南昌大学学报，2015，55（2）：96-99.

［11］孙洁.富血小板纤维蛋白生物学特性的研究［D］.天津：天津医科大学，2010.

［12］徐海燕，刘斌，安然.富血小板纤维蛋白的研究进展［J］.口腔医学研究，2015，31（9）：939-941.

［13］杨世茂，王明国.富血小板纤维蛋白的研究进展［J］.国际口腔医学杂志，2012，39（3）：373-375.

Changes of calbindin and collagenase-1 concentrations in repair of gingivaldefects

Dong Lu1，Yang Qinqiu2，Xiao Qiong3，Yin Xiaohua1，Chen Hongliang4，Sun Yong4△
（1.Department of Stomatology，First People′s Hospital of Liangshan Yi Autonomous Prefecture，Xichang，Sichuan 615000，China；2.Department of Stomatology，Suining Municipal First People′s Hospital，Suining，Sichuan 629000，China；3.Jiulongpo Dental Hospital of Chongqing Bybo Dental Hospital Administrative Co.，Ltd.，Chongqing 400051，China；4.Departmentof Stomatology，Institution Hospital of Chengdu Military Region，Chengdu，Sichuan 610041，China）

·论著·

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.10.001

A

1009-5519（2016）10-1441-02

成都军区“十二五”科研面上项目（C14050）。

董露（1986-），硕士研究生，主要从事口腔种植修复研究工作。

△，E-mail：2623457656@qq.com。

（2016-01-19）