重组质粒pαACP-HSP70的特异性表达研究*

杨名慧，赵学发，葛正龙△（.遵义医学院生物化学与分子生物学教研室，贵州遵义563003；.黔南州人民医院检验科，贵州都匀558000）

重组质粒pαACP-HSP70的特异性表达研究*

杨名慧1，赵学发2，葛正龙1△
（1.遵义医学院生物化学与分子生物学教研室，贵州遵义563003；2.黔南州人民医院检验科，贵州都匀558000）

目的观察重组质粒pαACP-HSP70在晶状体组织和非晶状体组织中的表达情况，探讨重组质粒pαACPHSP70的特异性表达。方法以晶状体组织作为A组，肺小细胞癌细胞A549、肝癌细胞7402等非晶状体组织作为B组，采用阳离子脂质体转染法将pCMV-HSP70质粒、pαACP-HSP70质粒导入A、B组后，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。结果转染pCMV-HSP70质粒到A、B组24 h后发现，两组均有绿色荧光；另外，转染pαACP-HSP70质粒24 h后仅在A组能观察到绿色荧光。结论重组质粒pαACP-HSP70不能在非晶状体组织表达，仅能在晶状体上皮细胞表达，具有组织特异性。

晶体；α晶体蛋白A链；HSP70热休克蛋白质类；绿色荧光蛋白质类；特异性

白内障作为首位致盲疾病，其导致视力障碍给白内障患者的生活质量带来极大的影响。手术治疗为白内障患者提供了最终治疗的有效手段，但手术治疗会给患者带来巨大的经济负担和风险及发生术后并发症［1］。因此，研究和发现新的预防、延缓白内障的非手术方法和措施具有显著意义。随着分子生物学技术的发展，基因治疗疾病引起人们的重视，通过导入外源基因来防治白内障的可行性处在研究阶段。目前，外源基因表达主要应用巨细胞病毒（CMV）启动子，CMV启动子虽然高效，但外源基因表达没有细胞特异性［2］。基因治疗所需解决的首要问题是外源基因的特异性表达，一方面增强对特定靶点的调控，另一方面减少对非特定靶点的干扰。组织特异性启动子的引入能够增强外源基因的特异性表达。本课题组前期成功构建特异性启动子αA晶体蛋白基因与热休克蛋白70（HSP70）基因片段重组质粒［3］，本研究继续深入研究重组质粒pαACP-HSP70是否具有组织特异性，为在白内障的基因防治中提供更多的实验依据。

1　材料与方法

1.1材料实验动物为6～8周SD大鼠，购于第三军医大学大坪医院实验动物中心，动物合格证：SCXK（渝2012-0005）；肝癌7402细胞、肺小细胞癌A549细胞购自中国科学院上海细胞库；pαACP-HSP70质粒、pCMVHSP70质粒（由本教研室构建）；多价阳离子脂质体（LipofectamineTM2000，美国Invitrogen公司）；D-（+）-半乳糖（美国Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1晶状体组织（A组）培养和转染将SD大鼠以颈椎脱臼法处死，立即取出眼球，无菌操作暴露完整晶状体，将其取出放入DMEM低糖培养基中（含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和20%胎牛血清），37℃5% CO2条件下培养8 h后，观察晶状体组织的情况，选取未受伤保持透明的晶状体组织纳入实验。换用DMEM低糖培养基（无抗生素无血清），各组分别加入pCMVHSP70质粒、pαACP-HSP70质粒（用LipofectamineTM2000包裹，质粒质量为4 μg，混合质粒，混合物体积为100 μL），转染过程按操作说明书进行，37℃5%CO2条件下培养24 h后行冰冻切片，在荧光显微镜下观察有无绿色荧光蛋白（EGFP）表达。

1.2.2非晶状体组织（B组）培养和转染将肺小细胞癌 A549细胞（B1组）、肝癌7402细胞（B2组）在10% FBS 1640培养基，37℃5%CO2培养箱内培养取对数生长期的细胞以1×106mL-1接种于六孔板中，待细胞生长接近80%～90%融合时，用 LipofectamineTM2000包裹pCMV-HSP70质粒、pαACP-HSP70质粒，转染过程按操作说明书进行，于瞬时转染后培养24 h，在荧光显微镜下观察细胞有无绿色荧光。

2　结　果

2.1A组转染pCMV-HSP70、pαACP-HSP70质粒24 h后冰冻切片荧光显微镜观察荧光显微镜下观察A组晶状体组织转染后冰冻切片的荧光变化如图1所示。pCMV-HSP70质粒组和pαACP-HSP70质粒组均观察到明显EGFP表达（图1a、b）；各组明场下均可见清晰晶状体上皮结构（图1c、d）。

图1　A组转染pCMV-HSP70、pαACP-HSP70质粒24 h后冰冻切片荧光显微图（100×）

2.2B组转染质粒24 h后荧光显微镜观察

2.2.1荧光显微镜下观察pCMV-HSP70质粒转染B1、B2组24 h后可见绿色荧光，如图2所示。

图2　B组转染pCMV-HSP70质粒24 h后荧光显微图（100×）

2.2.2荧光显微镜下观察pαACP-HSP70质粒转染B1、B2组24 h后均无绿色荧光，如图3所示。

图3　B组转染pαACP-HSP70质粒24 h后荧光显微图（100×）

3　讨　论

基因治疗是将外源基因导入靶细胞并在靶细胞内表达，产生所需要的产物，对特定的靶点进行调控，从而达到治疗疾病的目的。基因表达的组织特异性是受基因表达调控元件和细胞内调控蛋白所决定，因此，可以利用组织特异性启动子在一定器官或组织部位增加区域目的基因的表达量，减少目的基因对靶外组织产生毒性反应。有研究结果显示，利用可诱导的启动子能够调节基因治疗中目的基因的表达［4］。杨加伟等［5-6］利用马铃薯块茎特异性启动子、马铃薯叶片特异性启动子在块茎、叶片等组织获得高表达重组蛋白。

Massey等［7］研究表明，外源基因导入眼内后，可检测到晶状体内有相应蛋白表达。本课题组在前期的研究中，已成功将特异性启动子αA晶体蛋白基因与HSP70基因片段成功构建为融合质粒［3］。有研究发现，HSP对细胞上皮的完整性有保护作用，可避免应激因子的损伤［8］。HSP70为热休克蛋白家族重要成员，晶状体中HSP70的表达水平升高有利于稳定晶状体蛋白质的正确构象及晶状体的透明性，从而延缓和减轻白内障的发生［9-10］。αA晶体蛋白是晶状体细胞质中重要结构蛋白，已有研究证实，αA晶体蛋白仅局限在晶状体内表达，其他组织仅有少量被发现［11］。本课题组前期研究中，将pαACPHSP70质粒导入晶状体组织中，利用晶状体上皮细胞内的基因调控蛋白进行表达，能够定向使晶状体上皮细胞内的HSP70含量增高，起到防治白内障的作用［12］，但该重组质粒是否具有组织特异性还未知，因此进行以上研究。

pαACP-HSP70质粒与pCMV-HSP70质粒结构相同的是均含有内部核糖体进入位点序列（IRES）［13-14］和增强型EGFP基因编码区，IRES能够增强目的基因翻译水平的表达，使外源基因和EGFP基因同步表达，EGFP基因编码区可表达EGFP，可以通过荧光显微镜观察转染效率。pαACP-HSP70质粒与pCMV-HSP70质粒结构不同的是pCMV-HSP70质粒启动子为广谱启动子CMV，可表达于广泛的组织，而pαACP-HSP70质粒启动子为特异性启动子——αA晶体蛋白基因启动子，仅表达于晶状体上皮细胞。因此，本实验用荧光显微镜定性观察到转染pαACP-HSP70质粒24 h后晶状体上皮有绿色荧光，肺小细胞癌A549细胞、肝癌7402细胞观察无绿色荧光；转染pCMV-HSP70质粒24 h后晶状体上皮、肺小细胞癌A549细胞、肝癌7402细胞均有绿色荧光。提示重组pαACP-HSP70质粒具有组织特异性，能特异性表达于晶状体组织，不表达于非晶状体组织。但该质粒转染效率、目的基因在靶器官内表达水平等问题有待进一步研究。

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Research on specific expression of recombinant plasmid pαACP-HSP70*

Yang Minghui1，Zhao Xuefa2，Ge Zhenglong1△（1.Teaching and Researching Section of Biochemistry and Molecular Biology，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Department of Clinical Laboratory，Qiannan Prefecture People′s Hospital，Duyun，Guizhou 558000，China）

ObjectiveTo observe the expression of recombinant plasmid pαACP-HSP70 in the lens and non-lens tissues for investigating its specific expression.MethodsThe lens tissue was taken as the group A and the non-lens tissue of small cell lung cancer A549 cells and liver cancer 7402 cells as the group B.pCMV-HSP70 and pαACP-HSP70 plasmids were transfected into the group A and B by adopting the cationic lipofectin transfection method.The expression of enhanced green fluorescent protein produced in the two groups was observed by fluorescence microscope.ResultsAfter 24 h of pCMV-HSP70 plasmid transfection into the group A and B，the green fluorescence could be found in the two groups，however，after transfecting pαACPHSP70 plasmid，the green fluorescence could be found only in the group A.ConclusionThe pαACP-HSP70 recombination plasmid can not be expressed in non-lens tissue and only expressed in the lens epithelial cells with the tissue specificity.

Lens，crystalline；Alpha-crystallin A chain；HSP70 heat-shock proteins；Green fluorescent proteins；Specificity

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.005

A

1009-5519（2016）05-0651-03

贵州省优秀科技教育人才省长专项基金资助项目（黔省专合字［2009］47号）。

杨名慧（1986-），在读硕士研究生，主要从事生物技术应用方面的研究。

△，E-mail：zlongge@hotmail.com。

（2015-12-01）