低浓度冈田酸对人肝癌细胞SMMC-7721生长的影响*

邹倩倩，晏　容，3，刘　云，刘　流，李晓飞，3△（.遵义医学院基础医学院，贵州遵义563003；2.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州遵义563003；3.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，遵义563003）

低浓度冈田酸对人肝癌细胞SMMC-7721生长的影响*

邹倩倩1，晏容1，3，刘云2，3，刘流1，李晓飞1，3△
（1.遵义医学院基础医学院，贵州遵义563003；2.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州遵义563003；3.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，遵义563003）

目的探讨低浓度冈田酸（OA）对人肝癌细胞SMMC-7721生长的影响。方法（1）采用磺酰罗丹明（SRB）染色法检测不同低浓度OA（5.900 00、0.590 00、0.059 00、0.029 50、0.014 75 nmol/L）在体外对人肝癌细胞SMMC-7721的促增殖作用；（2）应用免疫荧光染色法检测不同低浓度OA对人肝癌细胞SMMC-7721增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响。结果SRB染色结果显示，浓度为5.900 00 nmol/L的OA对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖仍有抑制作用，随着OA浓度逐渐下降则出现促肝癌细胞增殖，但更低浓度组促增殖作用逐渐降低，浓度达到0.014 75 nmol/L时无促增殖作用。PCNA表达变化趋势与SRB结果一致。结论低浓度OA促进人肝癌细胞SMMC-7721的增殖。

癌，肝细胞；细胞增殖；增殖细胞核抗原；冈田酸

1981年Tachibana首次从冈田软海绵（Halichondria okadai）和隐海绵（H.melanodocia）中分离得到了具有特殊构造的聚醚（polyether）化合物——冈田软海绵酸，即冈田酸（OA）［1］。研究显示，OA作为参与调节细胞代谢、分化及凋亡、信号通路等一系列生理病理事件的经典蛋白磷酸酶2A（PP2A）的抑制剂，通过抑制PP2A的活性使磷酸化蛋白底物迅速累积，因此被认为是一种促癌物［2］。但文献显示，10 ng/mL的OA对人肝癌细胞BEL-7402的增殖有显著抑制作用［3］，作者进行的前期体外实验同样发现OA对人肝癌细胞SMMC-7721的生长有抑制作用，其半数抑制浓度（IC50）为59 nmol/L。这些研究结果均与OA作为一种公认的促癌物相矛盾。因此推测，OA作用于体外培养的肿瘤细胞，是否是由于浓度因素而直接影响肿瘤细胞的生长，而其抑制作用的发生可能是由于OA浓度较高所致。那么，低浓度下是否会出现相反的变化。为了解决这一疑问，本实验拟探讨低浓度OA对人肝癌细胞SMMC-7721生长的影响，为下一步研究OA的促癌机制提供有效的药物浓度数据参考和体外实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药物OA购自Sigma公司，用DMSO溶解，配制浓度为10 μmol/L的储备液，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。

1.1.2肝癌细胞株人肝癌细胞SMMC-7721购于中国科学院细胞库。

1.1.3试剂RPMI-1640培养基（美国Gibco公司），南美胎牛血清、胰蛋白酶（美国Hyclone公司），磺酰罗丹明（SRB，美国Sigma公司），牛血清白蛋白（BSA，美国Sigma公司），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美国Sigma公司），增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（Abcam公司），Cy3标记山羊抗小鼠二抗（美国Sigma公司）。

1.1.4主要仪器3131型CO2培养箱、Multiskan spectrum全波长酶标仪（美国Thermo公司），超净工作台（苏州净化设备有限公司），倒置显微镜（日本Nikon公司），荧光显微镜（德国Leica公司）。

1.2方法

1.2.1人肝癌细胞SMMC-7721的培养参照文献［4］进行细胞培养。

1.2.2SRB染色法取100 μL细胞悬液（4 000个细胞）平行接种于2块96孔板，一块为对照板（T0），另一块为实验板。于CO2培养箱中培养20 h后，将对照板取出，用预冷的50%三氯乙酸（TCA）固定待测，实验板中以加入不同低浓度OA（终浓度分别为5.900 00、0.59000、0.059 00、0.029 50、0.014 75 nmol/L）为实验组（T），同时设空白对照组（C），每组5个复孔，继续培养24 h后取出培养板，参照文献［5］进行SRB染色，最后在酶标仪上选择565 nm波长测吸光度（OD）值。按照公式计算生长增殖率。

1.2.3免疫荧光染色法检测人肝癌细胞SMMC-7721 PCNA的表达细胞悬液接种于48孔板中（细胞浓度为1×105个/mL，每孔100 μL），37℃、5%CO2培养20 h后弃培养基，再加入不同低浓度的OA（终浓度分别为5.900 00、0.590 00、0.059 00、0.029 50 nmol/L），空白对照组加等量的培养基，各组设3个平行孔。培养24 h后弃培养基，PBS清洗，每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，以 0.1%Triton X-100室温孵育 15 min，3%过氧化氢（H2O2）灭活内源过氧化物酶后，PBS清洗3次后加5% BSA 37℃封闭1 h，PBS清洗。滴加小鼠抗人PCNA抗体（1∶300）4℃孵育过夜（以PBS代替一抗作为阴性对照），PBS清洗3次，加入Cy3标记山羊抗小鼠二抗（1∶800）37℃孵育1 h，PBS清洗3次，DAPI染色30 min，PBS清洗后，置于荧光显微镜下观察并拍照。同时采用Image2XJ软件分析各组细胞细胞核中PCNA的表达量。

1.2.4染色观察为检测PCNA在人肝癌细胞SMMC-7721中的细胞定位，首先用免疫荧光染色对人肝癌细胞SMMC-7721内的PCNA进行定位分析，同时用DAPI对细胞核进行染色定位（蓝色荧光）。

1.3统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1不同低浓度OA对人肝癌细胞SMMC-7721的促增殖作用与空白对照组比较，浓度为5.900 0 nmol/L的OA对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖仍有抑制作用，但随着OA浓度逐渐下降则出现促肝癌细胞增殖，OA浓度为0.590 00 nmol/L时对肝癌细胞有明显的促增殖作用，随着浓度的下降促进肝癌细胞增殖作用愈加明显，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。但更低浓度组促增殖作用逐渐降低，浓度达到0.014 75 nmol/L时无促增殖作用。见图1。

图1　不同低浓度OA对人肝癌细胞SMMC-7721增殖作用的影响

2.2不同低浓度 OA对人肝癌细胞 SMMC-7721中PCNA表达的影响

2.2.1染色观察PCNA在人肝癌细胞SMMC-7721的细胞核及细胞质内均有表达（红色荧光），以细胞核表达为主。其PCNA在细胞核中的表达变化趋势与SRB结果一致。见图2。

2.2.2细胞核中PCNA相对表达量测定与空白对照组比较，OA浓度为5.900 00 nmol/L时肝癌细胞的PC NA表达显著降低，随着OA浓度逐渐下降PCNA表达呈上升趋势，OA浓度为0.590 00 nmol/L时肝癌细胞的PCNA表达增加显著，随着浓度的下降PCNA表达增加更明显，但随着浓度进一步下降（OA浓度为0.02950nmol/L）肝癌细胞的PCNA表达又呈下降趋势。见图3。

图3　不同低浓度OA对人肝癌细胞SMMC-7721中PCNA表达的影响

3　讨　论

OA作为一种公认的促癌物，能够促进肿瘤形成，在极低浓度范围就可对人类健康造成潜在的威胁［6］。国外学者研究发现，OA对PP2A有较强的选择性，并且能够促进小鼠体内肿瘤的生长［7］。但有研究结果提示，在体外水平OA能抑制肿瘤细胞的生长［3，8］，这与作者前期的实验结果相似。以上体外的研究结果与OA作为一种公认的促癌物相矛盾。课题组推测可能是较高浓度的OA抑制了肿瘤细胞的生长，降低其浓度则有可能出现相反的变化。因此本实验首先采用SRB法检测不同低浓度OA对人肝癌细胞SMMC-7721的促增殖作用。结果显示，浓度为5.900 00 nmol/L的OA对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖仍有抑制作用，随着OA浓度逐渐下降则出现促肝癌细胞增殖，但更低浓度组促增殖作用逐渐降低，浓度达到0.014 75 nmol/L时无促增殖作用，提示低浓度OA促进人肝癌细胞SMMC-7721的增殖。在此基础上，应用免疫荧光染色法检测不同低浓度OA对人肝癌细胞SMMC-7721中PCNA表达的影响。PCNA参与调节DNA的合成［9］，其表达水平和增殖细胞中DNA复制的活跃程度基本保持一致，通常被作为一项评估细胞增殖活性的重要指标。有实验证明，PCNA在细胞核内阳性表达的高低与细胞增殖活性密切相关。实验发现，细胞核中PCNA相对表达量的变化趋势与SRB结果一致，再次印证了低浓度OA对肿瘤细胞的促增殖作用。为下一步研究OA的促癌机制提供有效的药物浓度数据参考和体外实验依据。

以往研究认为，PCNA主要表达于细胞核，但是本实验结果显示，PCNA不仅定位于细胞核，在细胞质中也有表达，并且随着OA的浓度降低，细胞质中的表达量也呈现上升趋势。研究表明，在某些肿瘤细胞中，PCNA部分在细胞质表达并与多种肿瘤相关蛋白结合，提示细胞质中的PCNA可能参与了肿瘤的某些病理过程［10］。本实验提示，OA可能在细胞中对PCNA重新定位，介导PCNA在细胞质中参加其他肿瘤生物学行为，这与OA的促癌作用是否相关有待进一步研究。

［1］Tachibana K，Scheuer PJ，Tsukitani Y，et al.Okadaic acid，a cytotoxic polyether from two marine sponges of the genus Halichondria［J］.J Am Chem Soc，1981，103（9）：2469-2471.

［2］Rajesh D，Schell K，Verma AK.Ras mutation，irrespective of cell type and p53 status，determines a cell′s destiny to undergo apoptosis by okadaic acid，an inhibitor of protein phosphatase 1 and 2A［J］.Mol Pharmacol，1999，56（3）：515-525.

［3］陈洋，颜天，于仁成，等.OA对人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402增殖的影响和对细胞凋亡的诱导作用研究［J］.中山大学学报：自然科学版，2008，47（5）：86-92.

［4］晏容，刘云，朱欣婷，等.不同斑蝥素类物质对人肝癌细胞HepG2增殖作用的研究［J］.现代医药卫生，2015，31（21）：3209-3211.

［5］Vichai V，Kirtikara K.Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening［J］.Nat Protoc，2006，1（3）：1112-1116.

［6］Creppy EE，Traoré A，Baudrimont I，et al.Recent advances in the study of epigenetic effects induced by the phycotoxin okadaic acid［J］.Toxicology，2002，181/182：433-439.

［7］Suganuma M，Fujiki H，Suguri H，et al.Okadaic acid：an additional nonphorbol-12-tetradecanoate-13-acetate-type tumor promoter［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1988，85（6）：1768-1771.

［8］李伟，陶敏，陈凯，等.蛋白磷酸酶2A抑制剂对胰腺癌细胞丝裂原活化蛋白激酶信号通路的激活作用及对细胞生长的影响［J］.中华实验外科杂志，2013，30（1）：170.

［9］李新星，王坚.PCNA与Caspase-3在胆囊癌组织中的表达及其临床意义［J］.肝胆胰外科杂志，2012，24（1）：14-17.

［10］徐晓恒.增殖细胞核抗原胞质表达对乳腺癌细胞自噬调控作用的研究［D］.长春：吉林大学，2015.

Effect of low concentration of Okadaic acid on growth of human hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721*

Zou Qian-qian1，Yan Rong1，3，Liu Yun2，3，Liu Liu1，Li Xiaofei1，3△（1.College of Basic Medicine，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Medical and Biological Research Center，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；3.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines，Zunyi，Guizhou 563003，China）

ObjectiveTo explore the effect of low concentration of Okadaic acid（OA）on the growth of hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721.Methods（1）The sulforhodamine B（SRB）staining method was employed to detect the promoting proliferation effect of OA with different low concentrations（5.900 00，0.590 00，0.059 00，0.029 50，0.014 75 nmol/L）on hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721 in vitro.（2）The immunofluorescence staining method was used to detect the effect of OA with different low concentrations on the expression of SMMC-7721 proliferating cell nuclear antigen（PCNA）.ResultsThe SRB results showed that when the OA concentration was 5.900 00 nmol/L，it still had inhibiting effect on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721.However，as the gradual decline of OA concentration，it had a promotion effect on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells，but its proliferation promotion effect at even lower concentration was gradually decreased. When the concentration reached 0.014 75 nmol/L，there was no promotion effect on proliferation.The expression change tendency of PCNA was consistent with the results of SRB.ConclusionLow concentration of OA can promote hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721 proliferation.

Carcinoma，hepatocellular；Cell proliferation；Proliferating cell nuclear antigen；Okadaic acid

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.003

A

1009-5519（2016）05-0645-03

国家自然科学基金项目（81560669）；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目（黔教合KY字［2014］212）。

邹倩倩（1987-），在读硕士研究生，主要从事昆虫资源开发与利用方面的研究。

△，E-mail：lixiaofei35@sohu.com。

（2015-12-21）