EGFL7在鼻咽癌组织中的表达研究

赵燕恋，杨继红，卢永田，张　娟，苗芳芳，李洁萍（.深圳大学附属罗湖医院，广东深圳58000；.深圳市第二人民医院，广东58000）

EGFL7在鼻咽癌组织中的表达研究

赵燕恋1，杨继红1，卢永田2，张娟1，苗芳芳1，李洁萍1
（1.深圳大学附属罗湖医院，广东深圳518000；2.深圳市第二人民医院，广东518000）

目的观察表皮生长因子样结构域7（EGFL7）在鼻咽癌中的表达，探讨其临床意义。方法采用免疫组织化学方法检测2010年7月至2013年7月该院40例鼻咽癌患者蜡块标本（研究组）及20例鼻咽炎患者炎症组织（对照组）中EGFL7的表达；采用CD31抗体标记通过免疫组织化学方法检测研究组及对照组的微血管密度（MVD），并分析EGFL7的表达与肿瘤临床分期及MVD的相关性。结果两组EGFL7阳性表达率均很高（研究组为92.5%，对照组为85.0%），但二者比较，差异无统计学意义（P＞0.05），研究组中EGFL7高表达率（37.9%）高于对照组（10.0%），差异有统计学意义（P＜0.05）；研究组中EGFL7的表达与患者性别、年龄、EB病毒抗体无相关性（P＞0.05）；与EGFL17表达高低、临床分期及淋巴结转移有关（P＜0.05）。Pearson相关分析发现，EGFL7表达与MVD值呈正相关（r=0.700，P=0.000）。结论EGFL7在鼻咽癌细胞中有表达，并与鼻咽癌的生长和浸润转移关系密切；其可能通过影响血管的生成参与鼻咽癌的发展，有可能成为反映鼻咽癌转移及预后的标志物之一。

鼻咽肿瘤；表皮生长因子；结构域；毛细血管；肿瘤转移

表皮生长因子样结构域7（EGFL7）是一种内皮细胞特异性分泌因子，参与血管管腔的形成，肿瘤中有大量的新生血管，因此阻断新生血管EGFL7的表达可抑制肿瘤的生长和转移［1］。近年来有研究发现，EGFL7除限定于血管内皮系统外，在一些肿瘤细胞中也有表达。如上皮来源的肾癌［2］、喉癌［3-4］、胃癌［5］、乳腺癌［6］、肺癌［7］、肝癌［8］，以及间叶来源的人脑胶质瘤［9］等已有相关报道，但在鼻咽癌中是否表达鲜有相关报道。鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤之一，病因与种族易感性、遗传因素及EB病毒感染等有关，是较为特殊的上皮源性恶性肿瘤，也是黏膜上皮在鳞状上皮化生的基础上癌变形成的，含有丰富的淋巴组织，具有较强的免疫应答。但迄今为止，鼻咽癌缺乏敏感性、特异性高的标志物。本研究运用免疫组织化学（免疫组化）方法检测鼻咽癌（研究组）与鼻咽炎（对照组）组织中EGFL7的表达，采用CD31抗体进行免疫组化检测研究组及对照组的微血管密度（MVD），探讨EGFL7在鼻咽癌中的表达及其临床意义。

1　资料与方法

1.1一般资料收集本院2010年7月至2013年6月40例鼻咽癌患者的蜡块标本作为研究组，以同期20例鼻咽炎患者炎症组织作为对照组。研究组患者中男33例，女7例；有淋巴结转移16例，无淋巴结转移24例。依据鼻咽癌2008分期标准：Ⅰ、Ⅱ期32例，Ⅲ、Ⅳ期8例。对照组患者鼻咽炎包括以慢性炎症为主的慢性鼻咽炎及以腺体、淋巴增生为主的腺样体肥大。

1.2试剂及方法

1.2.1实验试剂及仪器兔抗人EGFL7单克隆抗体、鼠抗人CD31单克隆抗体（英国Abcam公司），山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体、抗体稀释液（北京中杉金桥生物技术有限公司），DAB浓缩加强型试剂盒（广州深达生物制品技术有限公司），组织切片机（Leica公司），显微镜（OLYMPUS公司），染色剂（SAKURA公司）。

1.2.2方法

1.2.2．1CD31、EGFL7免疫组化法检测具体步骤：所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。切片后放入65℃烤箱2 h，二甲苯3缸，每缸10 min，脱蜡；梯度乙醇水化，蒸馏水洗3 min，柠檬酸盐缓冲液高压修复3 min，自然冷却至室温；3%过氧化氢溶液抑制内源性过氧化物酶：室温放置10 min；以0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4）冲洗2min，共5次；Anti-CD31抗原、Anti-EGFL7抗原分别用抗体稀释液以1∶100稀释，均于4℃孵育过夜，PBS冲洗2 min，共5次，山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体于37℃孵育30 min；PBS冲洗2 min，共5次；DAB显色3 min；苏木素复染1 min，盐酸乙醇分化5 s，蒸馏水返蓝1 min。梯度乙醇脱水﹑二甲苯透明﹑中性树胶封片。

1.2.2.2判断标准EGF7为细胞质染色，评分标准参照Shimizu方法。（1）染色程度：细胞质无显色为0分；细胞质呈云雾状淡黄色为1分；细胞质呈黄色颗粒状为2分；细胞质均匀深黄色为3分；（2）阳性细胞所占比例：阳性细胞数小于或等于10%为0分；＞10%～40%为1分；＞40%～70%为2分；＞70%为3分。（3）总积分为着色强度评分与阳性细胞所占比例评分之和；（4）总积分0分为（-），1～2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++）。（5）总积分大于或等于3分为高表达，＜3分为低表达。根据Vimtemin结果评判：细胞质染色出现棕黄色为阳性，每张切片随机观察5个高倍视野，计数500个细胞中染色阳性的细胞，阳性细胞小于或等于10%为阴性，＞10%为阳性。

1.2.2.3MVD测定MVD计数：在200倍镜下随机记录5个视野血管数，取平均值进行统计学处理。

1.3统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验；采用Pearson相关性检验，检验水平α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1两组EGFL7表达情况研究组阳性表达37例（92.5%），对照组阳性表达17例（85.0%），两组EGFL7阳性表达率均较高，但二者比较，差异无统计学意义（χ2=0.208，P＞0.05）。研究组高表达25例（62.5%），对照组中高表达2例（10.0%），两组比较，差异有统计学意义（χ2=4.966，P＜0.05）。见图1、表1。

2.2两组MVD表达情况研究组MVD均值为（67.008± 22.122），对照组为（71.420±16.187），两组比较，差异无统计学意义（t=-0.791，P＞0.05）。但研究组中EGFL7高表达、有淋巴结转移及临床分期高（Ⅲ期）的标本中MVD值较低表达、无淋巴结转移及临床分期低（Ⅰ～Ⅱ期）标本高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。研究组中各组MVD情况见表2，图2、3。

图1　EGFL7在鼻咽癌及鼻咽炎中的表达（200×）

表1　EGFL7与研究组鼻咽癌组织临床病理特征的关系［n（%）］

表2　研究组中MVD与EGFL7、淋巴结转移情况及临床分期的相关性±s）

表2　研究组中MVD与EGFL7、淋巴结转移情况及临床分期的相关性±s）

M V D分组n t P E G F L 7低表达E G F L 7高表达有淋巴结转移无淋巴结转移T N M分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ2 5 1 5 1 6 2 4 5 5 . 0 8 8 ± 1 7 . 2 7 5 8 6 . 8 7 3 ± 1 3 . 2 3 7 8 1 . 2 1 9 ± 2 0 . 9 6 5 5 7 . 5 3 3 ± 1 7 . 5 8 0 -6 . 1 1 8 0 . 0 0 0 -3 . 8 6 5 0 . 0 0 0 3 2 8 6 2 . 6 5 3 ± 2 2 . 1 9 6 8 4 . 4 2 5 ± 1 0 . 5 5 5 -2 . 6 8 0 0 . 0 1 1

图2　研究组EFGL7高、低表达组中CD31标记的MVD结果（200×）

图3　研究组有、无淋巴结转移组中CD31标记的MVD结果（200×）

2.3研究组鼻咽癌组织中MVD与EGFL7表达的相关性分析经Pearson分析发现，鼻咽癌组织中MVD值与EGFL7的表达呈正相关（r=0.700，P=0.000）。见图4。

图4　研究组鼻咽癌组织中MVD与EGFL7表达的相关性散点图

3　讨　论

以往研究大多以肿瘤与正常组织进行对比，但鉴于伦理问题，不可能取正常组织标本作为实验对照，即便是癌旁组织，其血供也相当丰富。本研究以鼻咽癌患者标本为研究组，以同期鼻咽炎患者炎症组织作为对照组。过去研究认为，EGFL7的表达仅限于血管内皮系统，但目前部分研究发现，一些肿瘤细胞也可表达EGFL7。本研究检测结果显示，EGFL7在鼻咽癌细胞中及炎症组织中阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；其原因可能是鼻咽部位特殊，本身富含血管及淋巴管，鼻咽炎中血管丰富，而EGFL7在血管内皮有较强的表达，所以鼻咽炎组织中EGFL7的阳性表达高。但鼻咽癌组织中的EGFL7高表达率要高于鼻咽炎组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明不仅血管内皮系统有EGFL7，鼻咽癌细胞中也有表达EGFL7的可能。本研究结果显示，在鼻咽癌细胞质中有EGFL7的表达正好诠释这点。另外，本研究发现，研究组中EGFL7表达水平与MVD呈正相关（r=0.700，P=0.000），且鼻咽癌组织中EGFL7的表达还与临床分期及淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。作者推测，EGFL7可能通过影响血管的生成参与鼻咽癌的发展。鼻咽癌的侵袭生长高度依赖于新生血管，其可以从中获取营养物质，同时鼻咽癌周围的血管改变构成了一个有利于肿瘤生长的微环境，促进肿瘤的生长与侵袭，鼻咽癌的侵袭、转移与血管新生是相互作用、相互依存的［10-11］。EGFL7在鼻咽癌中的作用机制可能是肿瘤内皮细胞通过分泌的EGFL7蛋白易化肿瘤细胞内渗入血流中；同时微血管内皮细胞也表达EGFL7蛋白，并且从血流中捕获肿瘤细胞，易化肿瘤细胞以血管外渗方式进入新的组织器官［1，12］。随着鼻咽癌临床及病理级别的增加，其血管新生的活跃程度也增加，EGFL7的表达也随着肿瘤浸润程度加深而增加［13］。

综上所述，EGFL7的表达与鼻咽癌及其浸润、转移有密切关系，EGFL7可能成为反映鼻咽癌转移及预后的标志物之一，但要作为鼻咽癌的特异性抗体有待于进一步考证。鼻咽癌的侵袭、转移除了血行转移外，还可通过淋巴途径，尤其对于鼻咽癌，淋巴转移尤为重要；而且鼻咽癌是较为特殊的上皮源性恶性肿瘤，不仅血管丰富，其上皮下是更为丰富的淋巴组织，具有较强的免疫应答［14-15］。那么EGFL7在淋巴内皮中是否也有表达，EGFL7是否对血管、淋巴管具有双重作用，也可能成为新的研究亮点。

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Study on expression of EGFL7 in nasopharyngeal carcinoma tissue

Zhao Yanlian1，Yang Jihong1，Lu Yongtian2，ZhangJuan1，Miao Fangfang1，Li Jieping1（1.Affiliated Luohu Hospital of Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518000，China；2.Shenzhen Municipal Second People′s Hospital，Shenzhen，Guangdong 518000，China）

ObjectiveTo observe the epidermal growth factor structure domain 7（EGFL7）expression in nasopharyngeal carcinoma（NPC），and to explore its clinical significance.MethodsThe immunohistochemical method was used to detect the EGFL7 expression in 40 NPC tissue paraffin samples（study group）and 20 nasopharyngitis tissue samples（control group）in our hospital from July 2010 to July 2013；the CD31 antibody labeling immunohistochemical method was adopted to detect the microvas cular density（MVD）in the study group and control group，then the correlation between the EGFL7 expression with tumor clinical stage and MVD was analyzed.ResultsThe EGFL7 positive expression rate in the two groups was higher（92.5%for the study group and 85.0%for the control group），but there was no statistically significant difference between them（P＞0.05）.The EGFL7 high expression rate in the study group was higher than that in the control group，the difference was statistically significant（37.9% vs.10.0%，P＜0.05）；the EGFL7 expression in the study group had no correlation with the patients′gender，age and EB viral anti body（P＞0.05）；and had correlation with the high and low expression of EGFL7，lymph node metastasis and clinical stage（P＜0.05）. The Pearson correlation analysis found the positive correlation between EGFL7 expression and MVD value（r=0.700，P=0.000）. ConclusionEGFL7 is expressed in NPC cells，moreover is closely associated with the growth，invasion and metastasis of NPC，which may participate in the development of NPC by affecting the blood vessels generation and may become one of markers reflecting NPC metastasis and prognosis.

Nasopharyngeal neoplasms；Epidermal growth factor；Domains；Capillaries；Neoplasm metastasis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.007

A

1009-5519（2016）04-0497-03

赵燕恋（1980-），硕士研究生，主治医师，主要从事鼻咽癌基础与临床研究。

（2015-11-21）