鸡血藤不同成分抗AA诱导的血小板聚集作用的实验研究

尹小明，赵诗云，饶丽华，彭旦明，吴东风，伍柏青

（1、江西省人民医院检验科，江西南昌330006；2、江西省中医药研究院药理研究所，江西 南昌330077；3、南昌市中西医结合医院检验科，江西 南昌330003）

鸡血藤不同成分抗AA诱导的血小板聚集作用的实验研究

尹小明1，赵诗云2，饶丽华3，彭旦明2，吴东风2，伍柏青1

（1、江西省人民医院检验科，江西南昌330006；2、江西省中医药研究院药理研究所，江西 南昌330077；3、南昌市中西医结合医院检验科，江西 南昌330003）

目的 筛选由花生四烯酸（AA）诱导的鸡血藤抗血小板聚集作用的有效成分。方法 采用水提醇沉法，得鸡血藤浸膏（总成分），用AB-8大孔吸附树脂提取其中的总黄酮成分，提取黄酮后剩下的滤液即为非黄酮成分。实验分组：分为鸡血藤浸膏组、总黄酮成分组、非黄酮成分组、阿司匹林对照组、生理盐水对照组。分别给SD大鼠灌胃高、中、低不同剂量的鸡血藤各组分。测定由AA诱导的血小板5min之内的最大聚集率。结果 鸡血藤浸膏高、中、低剂量各组的聚集率（%）分别为：4. 6±1.1、8.3±2.0、42.5±4.2；鸡血藤总黄酮成分高、中、低剂量各组的聚集率（%）分别为：6.4±1.5、37.6±3.5、70.1±4.3；鸡血藤非黄酮成分高、中、低剂量各组的聚集率（%）分别为：65.7±3.2、69.0±3.8、72.5±4.4；阿司匹林对照组的聚集率（%）为：41.6±3.8；正常对照组的聚集率（%）为：70.3±4.6。鸡血藤浸膏组、鸡血藤总黄酮成分组（低剂量组除外）、阿司匹林组分别显著性低于正常对照组（P＜0.01）。鸡血藤非黄酮成分高、中、低剂量各组与生理盐水对照组比较，结果无显著性差异（P＞0.05）。结论 鸡血藤总黄酮具有显著性的抗AA诱导的血小板聚集作用，为开发新的抗血小板聚集药物打下基础。

鸡血藤；总黄酮；阿司匹林；花生四烯酸；血小板聚集率

鸡血藤主要含有黄酮类、萜类、甾醇类、蒽醌类、内酯类、苷类及其它类型化合物，具有抗贫血、抗肿瘤［1，2］，抗病毒［3］等作用。但是鸡血藤抗血小板聚集作用的报道较少［4］。是什么组分在体内具有抗AA诱导的血小板聚集作用？鸡血藤总黄酮是否有抗AA诱导的血小板聚集作用，尚未见报道。筛选鸡血藤抗AA诱导的血小板聚集作用的有效成分，可以避免因成分不明而带来的毒副作用。

1　材料与方法

1.1材料鸡血藤购于广西普宁市百草中药饮片有限公司，生产批号：13020202。为豆科密花豆属植物密花豆的干燥藤茎。SD大鼠，均为雄性，SPF级，体质量（200±5）g，合格证号：JZDW No：2013-0024。仪器与试剂AggRam血小板聚集仪。试剂为原装配套试剂，花生四烯酸批号：21224990。

1.2方法

1.2.1鸡血藤浸膏的提取鸡血藤1.0kg，水煎半小时，共煎煮2次，合并滤液，浓缩，再用70%乙醇去蛋白，减压蒸干，得鸡血藤浸膏，精密称量，用重蒸馏水配成10.93mg·ml-1，消毒，置4℃冰箱备用。

1.2.2鸡血藤总黄酮的提取按上述方法获得鸡血藤的浸膏，参照文献方法［5-9］，用AB-8大孔吸附树脂吸附，依次用水和25%、50%、70%的乙醇洗脱，合并洗脱液并减压蒸干，得鸡血藤总黄酮化合物。精密称量，用重蒸馏水配成6.00mg·ml-1，消毒，置4℃冰箱备用。

1.2.3鸡血藤非黄酮成分的提取上述去黄酮的滤液浓缩减压干燥，精密称量，用重蒸馏水配成68.42mg·ml-1，消毒，置4℃冰箱保存备用。

1.2.4动物实验SD大鼠分为鸡血藤浸膏组、总黄酮成分组、非黄酮成分组、阿司匹林对照组和正常对照组。鸡血藤浸膏组、黄酮成分组、非黄酮成分组，各组又分别分为高、中、低剂量3个小组，每小组10只SD大鼠。阳性对照组和正常对照组各10只。鸡血藤浸膏组高剂量为145.4mg·kg-1体质量、中剂量为72.9mg·kg-1体质量、低剂量为36.5mg· kg-1体质量；黄酮部位高剂量为88.9mg·kg-1体质量、中剂量为 66.6mg·kg-1体质量、低剂量为44.5mg·kg-1体质量； 非黄酮部位高剂量为120.0mg·kg-1体质量、中剂量为60.0mg·kg-1体质量、低剂量为30.0mg·kg-1体质量。分别给SD大鼠灌胃上述不同剂量的鸡血藤浸膏、总黄酮成分、非黄酮成分，以及阿司匹林50.0mg·kg-1体质量；正常对照组给SD大鼠灌胃生理盐水10.0ml·kg-1体质量。每天一次，连续给药2d，末次给药后4.0h取血4.0ml，立即测定血小板5min内最大聚集率，2h内完成。

1.2.5鸡血藤抗血小板聚集的测定参照尹小明等建立的 “SD大鼠血小板聚集试验的测定方法”［10］，测定5min内血小板最大聚集率。即：将225μl富血小板血浆放入比色杯中，并放入1颗磁珠，放置2～3min预热，再加入25μl AA（浓度5000μg·ml-1），同时按下“按钮”，仪器自动开始连续测定血小板5min内最大聚集率。

1.3统计学方法应用EXCEL软件对数据进行统计学处理分析，正态分布计量资料采用均值±标准差（±s）表示，不同组分药物进行组间比较采用成组t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1阿司匹林组，给予阿司匹林50.0mg·kg-1体质量，SD大鼠血小板的聚集率为41.62%。正常对照组，给予生理盐水10.0ml·kg-1体质量，SD大鼠血小板聚集率为70.3%。阿司匹林组与正常对照组比较，具有显著性差异（P＜0.01）。

2.2鸡血藤浸膏抗血小板聚集的结果鸡血藤浸膏组高剂量145.4mg·kg-1、中剂量72.9mg·kg-1、低剂量36.5mg·kg-1体质量，SD大鼠血小板5min内的最大聚集率分别为：4.3%、8.3%、42.5%。各剂量组与正常对照组比较具有非常显著性差异 （P＜0.01），见表1。

表1　鸡血藤浸膏对AA诱导SD大鼠血小板聚集的影响（±s，n=10）

表1　鸡血藤浸膏对AA诱导SD大鼠血小板聚集的影响（±s，n=10）

注：—：给予生理盐水10.0ml·kg-1，与正常对照组比较**P＜0.01。

组别5min内最大聚集率（%）血小板抑制率（%）正常对照组阿司匹林组高剂量组中剂量组低剂量组P值剂量（mg·kg-1）—50.0 145.4 72.9 36.5 70.3±4.6 41.6±3.8**4.6±1.1**8.3±2.0**42.5±4.2**0.00 40.8 93.5 88.2 39.5

2.3鸡血藤总黄酮抗血小板聚集的结果鸡血藤总黄酮组高剂量88.9mg·kg-1、中剂量66.7mg·kg-1、低剂量44.5mg·kg-1体质量，SD大鼠血小板5min内的最大聚集率分别为：6.6%、37.6%、70.1%。鸡血藤总黄酮高、中剂量组与正常对照组比较具有非常显著性差异（P＜0.01），低剂量组与正常对照组比较无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2　鸡血藤总黄酮对AA诱导SD大鼠血小板聚集的影响（±s，n=10）

表2　鸡血藤总黄酮对AA诱导SD大鼠血小板聚集的影响（±s，n=10）

注：—：给予生理盐水10.0ml·kg-1，与正常对照组比较**P＜0.01，与正常对照组比较ΔP＞0.05。

组别5min内最大聚集率（%）血小板抑制率（%）正常对照组阿司匹林组高剂量组中剂量组低剂量组P值剂量（mg·kg-1）—50.0 88.9 66.7 44.5 70.3±4.6 41.6±3.8**6.4±1.5**37.6±3.5**70.1±4.3Δ0.00 40.8 91.0 46.5 0.28

3.4鸡血藤非黄酮成分组抗血小板聚集的结果鸡血藤非黄酮成分高剂量81.5mg·kg-1、中剂量40.7mg·kg-1、低剂量20.4mg·kg-1体质量，SD大鼠血小板的 5min内最大聚集率分别为：65.7%、69.0%、72.5%。各剂量组与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05），见表3。

表3　鸡血藤非黄酮成分对AA诱导SD大鼠血小板聚集的影响（±s，n=10）

表3　鸡血藤非黄酮成分对AA诱导SD大鼠血小板聚集的影响（±s，n=10）

注：—：给予生理盐水10.0ml·kg-1，与正常对照组比较**P＜0.01，与正常对照组比较ΔP＞0.05。

组别5min内最大聚集率（%）血小板抑制率（%）正常对照组阿司匹林组高剂量组中剂量组低剂量组P值剂量（mg·kg-1）—50.0 81.5 40.7 20.4 70.3±4.6 41.6±3.8**65.7±3.2Δ69.0±3.8Δ72.5±4.4Δ0.00 40.8 6.5 1.3 1.8

3　讨论

鸡血藤主要用于治疗月经不调，血虚萎黄，麻木瘫痪，风湿痹痛等。本研究结果显示：鸡血藤总黄酮具有良好的抗AA诱导的血小板聚集作用。因为SD大鼠的血小板聚集率检测与人类的血小板聚集率检测不完全一样，为了保证数据的可信性，本实验在数据采集前，建立了SD大鼠血小板聚集实验的方法［10］。血小板聚集是指血小板与血小板之间相互黏附形成血小板团，参与血小板聚集的主要因素有诱导剂、血小板膜糖蛋白Ⅱb、Ⅲa复合物（GPⅡb/Ⅲa）、纤维蛋白原和Ca2+。诱导剂主要有花生四烯酸（AA），二磷酸腺苷、胶原、凝血酶、肾上腺素等。在血小板聚集过程中，血小板会发生释放反应，释放出AA，AA的代谢产物是血小板聚集作用的集中表现，AA代谢产物的血栓烷A2（TXA2）具有促进血小板聚集和收缩血管的作用。

影响血小板聚集的药物作用机制各不相同，有的具有双重作用，如：乙二胺四乙酸盐（EDTAK2）可使肝素诱导的血小板发生解聚［11］；同时，也会使少数病例引起血小板聚集，形成血小板假性减少［12-15］，硝苯地平则以浓度依赖的方式抑制血小板聚集［16］。而阿司匹林抗血小板聚集作用的靶点是TXA2。鸡血藤抗血小板聚集具有类似阿司匹林样作用，鸡血藤抗AA诱导的血小板聚集作用的成分是总黄酮，其作用靶点也可能是TXA2。阿司匹林抗AA诱导的血小板聚集作用的过程中具有出血副反应；而鸡血藤总黄酮抗血小板聚集作用的过程中，是否也有出血副反应尚未见报道，鸡血藤总黄酮抗AA诱导的血小板聚集作用的毒理实验正在研究中。

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Screening of the effective parts of spatholobus suberectus on anti-platelet aggregation

YIN Xiaoming1，ZHAO Shiyun2，RAO Lihua3，PENG Danming2，WU Dongfeng2，Wu Boqing1.1.Department of Clinical Laboratory，Jiangxi Provincial People's Hospital，Nanchang 330006，China；2.Institute of Chinese Medicine，Jiangxi Provincial Traditional Chinese Medicine Academy，Nanchang 330077，China；3.Department of Clinical Laboratory，Nanchang Hospital of Integrated Traditional Chinese Medicine and Westen Medicine，Nanchang 330003，China.

Objective To screen the effective parts of spatholobus suberectus on anti-platelet aggregation.Methods Overall composition of spatholobus suberectus（OCSS）were extracted by water extraction and alcohol precipitation，then total flavonoids（TFSS）and nonflavonoids parts（NFPSS）in overall composition of spatholobus suberectus were separated by AB-8 macroreticular resin. Healthy SD rats divided into 11 groups were given a high，medium，low dose of OCSS，TFSS，NFPSS by intragastric administration individually for 2 days，and the maximum aggregation rate of platelet（MARP）induced by arachidonic acid（AA）were detected.Results The MARPs in positive group，overall composition group and total flavonoids group（except the low dose group）were significantly lower than those in negative group（P＜0.01），while there was no significant difference between nonflavonoids part group and negative group（P＞0.05）.Conclusion Flavonoids is the effective part of spatholobus suberectus on anti-platelet aggregation.

Spatholobus suberectus；Total flavonoids；Aspirin；Arachidonic acid；Platelet aggregation

R446.11+1，R558+.9

A

1674-1129（2016）04-0422-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.004

江西省卫省厅中医药科研基金资助项目（2012A127）

尹小明，男，1966年10月出生，学士，副主任技师，主要从事血栓与止血检验之中医药抗血小板聚集的研究。Tel：15979109623.E-mail：YXM_168@126.com

（2016-03-18；

2016-07-10）