慢性乙型肝炎患者幽门螺杆菌感染状况及肝组织螺杆菌属特异性16SrRNA基因分析*

王晓忠，窦逾常，王　燕，庄小芳

慢性乙型肝炎患者幽门螺杆菌感染状况及肝组织螺杆菌属特异性16SrRNA基因分析*

王晓忠，窦逾常，王燕，庄小芳

目的分析慢性乙型肝炎患者幽门螺杆菌（Hp）感染状况及肝组织螺杆菌属特异性16SrRNA基因特点。方法纳入维吾尔族CHB患者60例和健康维吾尔族体检者80例，采用14C-尿素呼气试验检测H pylori阳性感染，常规进行肝穿刺，采用PCR法检测肝组织螺杆菌16SrRNA基因水平。结果慢性乙型肝炎每分钟衰变数（14C-UBT）阳性率为85.00%，显著高于对照组[60.24%，P<0.01]；在所谓的60例慢性乙型肝炎患者中，经肝组织学检查，发现慢性乙型肝炎46例，肝硬化14例；在46例CHB和14例肝硬化患者肝组织DNA进行16 SrRNA基因检测，结果40例（86.96%）CHB和13例（92.86%）肝硬化患者16 sRNA阳性，两组差异无统计学意义（x2=0.363，P>0.05）；轻度、中度与重度CHB患者肝组织16 sRNA检出率亦无统计学差异（x2=1.348，P=0.510）。结论慢性乙型肝炎患者幽门螺杆菌感染率较高，但肝组织螺杆菌属特异性16SrRNA检出率与乙型肝炎患者肝组织炎症或纤维化程度未显示出显著性关联。

慢性乙型肝炎；幽门螺杆菌；肝组织；螺杆菌属特异性16SrRNA

【Abstract】ObjectiveTo analyze the Helicobacter pylori（Hp）infection status in Uygur patients with chronic hepatitis B in Xinjiang and helicobacter 16SrRNA gene in liver biopsy tissues.Methods60 patients with hepatitis B and 80 healthy persons were recruited in this study.14C-urea breathing test was used to detected Hp infection，and helicobacter 16SrRNA gene in liver biopsy tissues were detected by using real-time PCR and pathological examination was applied to determine histological activity index.ResultsThe14C-UBT positive rate was 85.00%in patients with hepatitis B，significantly higher than 60.24%in the controls（P<0.01）;14 out of 60 patients with hepatitis B were diagnosed with liver cirrhosis by histopathological examination;the positive rate of helicobacter 16SrRNA in liver tissues from patients with CHB were 86.96%，without significant difference as compared to 92.86%from patients with liver cirrhosis（x2=0.363，P>0.05）；there were no significantly statistical differences as respect to the positive rates of helicobacter 16SrRNA in liver tissues among 21，16 and 9 patients with hepatitis B of mild，moderate and severe degree（x2=1.348，P=0.510）.ConclusionThe infection of Hp in patients with CHB is common，but there is no significant evidence showing correlation of the specificity 16SrRNA of Hp to pathological grading and staging in liver tissues.

【Key words】Chronic hepatitis B；Helicobacter pylori；16SrRNA of Hp;Liver biopsy

既往研究发现，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H pylori）或螺杆菌属合并乙型肝炎病毒（HBV）感染可能进一步加重慢性肝损害[1~4]。因此，根除治疗H pylori感染可能使慢性肝炎患者受益[5~7]。

既往已进行了一些H pylori感染与肝硬化相关并发症之间的相关性研究，得到了一致的肯定结果[8，9]，但对H pylori感染与CHB患者肝纤维化程度之间的关系报导不一[10，11]。维吾尔族是新疆主要的少数民族。在2005年末，维吾尔族人口约为923.50万，占新疆总人口的45.94%。近年有报道，维吾尔族人口已突破千万。2004年在和田地区进行的一项流行病学调查显示，维吾尔族人口HBV感染率为1.48%[12]，低于汉族（6.09%）。维吾尔族慢性乙型肝炎患者H pylori感染的状况仍不清楚。本研究观察了维吾尔族慢性乙型肝炎患者H pylori或螺杆菌属感染的特点，现报道如下。

1　资料与方法

1.1病例来源选择2013年4月至2014年12月在我院和新疆自治区人民医院诊治的维吾尔族CHB患者60例，男性48例，女性12例；平均年龄（41.33±11.48）岁。病程（8.64±8.25）年。CHB的诊断参照2010年中华医学会肝病学分会和感染病学分会更新的《慢性乙型肝炎防治指南》[1]，同时参照2006年中国中西医结合学会肝病专业委员会发布的《肝纤维化中西医结合诊疗指南》[13]。排除合并HCV感染、自身免疫性疾病、代谢性疾病、饮酒、药物等致肝损害，排除肝衰竭、肝硬化、肝癌，排除伴有其他系统严重疾病或精神病、孕妇和哺乳期妇女。另选健康维吾尔族体检者80例，男性40例，女性40例；平均年龄（46.46±16.45）岁，排除甲、乙、丙、戊型肝炎病毒感染，肝功能正常。

1.2肝穿刺活体组织检查采取快速肝穿刺术。术前检查血小板、凝血功能指标、测血压和脉搏。将活检获得的肝组织置入10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，行常规HE染色，由病理科医生进行病理组织学诊断，同时行嗜银染色，观察是否有幽门螺杆菌菌体在肝内定植。肝组织病理学诊断标准[14，15]：（1）轻度慢性肝炎：炎症活动度（G）1～2级，纤维化程度（S）0～2期；（2）中度慢性肝炎：G3，S1～3；（3）重度慢性肝炎：G4，S2～4。

1.314C-尿素呼气试验患者口服1粒14C-尿素胶囊（深圳中核海得威生物科技有限公司，每粒含尿素14C 27.8 KBq和该公司生产的HUBP-01A Hp测试仪），待瓶中液体由紫红色变为无色时，停止吹气（1～3 min）。当超过3 min褪色不全，也停止吹气，向已采集呼气样品的集气瓶内加入稀释闪烁液=4.5 ml，摇匀，测量样品每分钟衰变数（14C-UBT）>100 dpm/mmol CO2%时，则判定为H pylori阳性。1.4血清HBV标志物检测采用酶联免疫吸附法检测血清乙型肝炎病毒标志物（上海科华生物工程股份有限公司）。

1.5血清HBV DNA检测采用荧光定量PCR法检测（中山大学达安基因股份有限公司）。

1.6肝组织螺杆菌菌属特异性16 SrRNA基因检测取肝组织，采用3 S柱提取DNA（北京天根生化科技有限公司）。PCR反应总体系为20μl，包括Taq DNA聚合酶1μl。10×Buffer 5 μl，25 M MgCl23.6 μl（终浓度为1.8 mM），10 mM dNTPs 1μl（终浓度为200 M），25 M引物各1 μl（终浓度分别为0.5 mM），DNA模板l μl，其余用灭菌水补足。相关引物序列及PCR反应条件见表1。取螺杆菌16 SrRNA基因扩增产物10 μl，加入溴酚蓝2 μl，点样于含0.2%溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶中，100 V电压电泳30 min，于紫外灯下观察结果，并应用紫外成像系统（Gel DocTM XR+imaging System，BIO RAD）拍照。

1.7统计学方法应用SPSS 16.0统计学软件，率的比较采用x2检验，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05，即P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1肝组织病理学分级和分期情况结果显示，在60例CHB患者中，14例达到肝硬化诊断标准，见表2。

2.2两组人群14C-尿素呼气试验阳性率比较CHB患者14C-UBT阳性率显著高于对照组（x2=10.291，P<0.01，表3）。

2.3两组14C-尿素呼气试验水平比较结果显示，CHB患者14C-UBT实测水平显著高于对照组（t=4.238，P<0.01，表4）。

2.4 CHB与肝硬化患者肝组织螺杆菌属特异性16 sRNA检出率比较对46例CHB和14例肝硬化患者肝组织DNA进行16 SrRNA基因检测（图1），结果40例（86.96%）CHB和13例（92.86%）肝硬化患者16 sRNA阳性，两组差异无统计学意义（x2=0.363，P>0.05）；轻度、中度与重度CHB患者肝组织16 sRNA检出率亦无统计学差异（x2=1.348，P=0.510，表5）。2.5血清HBV DNA阳性与阴性患者14C-尿素呼气试验阳性率比较血清HBV DNA阳性与阴性者14C-UBT阳性率的差异无统计学意义（x2=2.348，P>0.05，表6）。

表1　螺杆菌菌属特异性16 SrRNA基因引物序列及PCR反应条件

表2　 60例CHB患者肝组织病理学分级和分期情况分布

表3　两组人群14C-UBT阳性率（%）比较

表4　两组人群14C-UBT实测水平（）比较

表4　两组人群14C-UBT实测水平（）比较

①P<0.01

例数14C-UBT慢性乙型肝炎60502.07±360.36①健康人80199.37±93.48

表5　慢性肝炎与肝硬化患者肝组织16 sRNA检出率（%）比较

表6　血清HBV DNA阳性与阴性者14C-UBT阳性率（%）比较

图l　慢性HBV感染者肝组织螺杆菌菌属特异性16 SrRNA基因扩增情况（自左至右）：1，Marker；2～7，慢性肝炎；8～10，肝硬化

3　讨论

H pylori与慢性胃炎、消化性溃疡等胃肠道疾病的关系已被公认。近年研究资料表明，H pylori不但引起许多慢性感染和免疫反应，还参与了胃肠外疾病如心脏疾病、血液性疾病、风湿性疾病、肝硬化、肝癌的发生和发展过程。1992年美国的Fox et al[16]首先发现肝螺杆菌与A/J小鼠肝脏疾病的发生发展关系密切。Chen[17]发现乙型肝炎肝硬化患者H pylori感染率明显高于健康人，且H pylori感染与血氨升高有明显的相关性。因此，H pylori感染在肝性脑病发生中具有重要作用。Nilsson et al[18，19]在原发性硬化性胆管炎和原发性胆汁性肝硬化患者肝组织中发现螺杆菌16 SrRNA基因存在，测序证明与H pylori具有99%同源性。因为人类对HP有普遍的易感性，所以近年来人们开始关注Hp与慢性肝病之间的关系。

既往流行病学调查显示，维吾尔族人群H pylori感染率（59.8%）高于汉族和哈族[20]。本研究发现维吾尔族健康人H pylori感染率为60%，而维吾尔族慢性乙型肝炎患者H pylori感染率则高达85%，高于广西（31.25%）[21]、江苏（62.7%）[22]等地区报道的汉族慢性乙型肝炎患者。本研究调查对象大多来自南疆。南疆气候干旱、沙尘肆虐，生活环境较为恶劣，产业以农业为主。慢性乙型肝炎患者高H pylori感染率是否与生活环境有关，有待今后进一步研究。本研究结果显示，慢性肝炎组与肝硬化组肝组织螺杆菌属特异性16 sRNA检出率无统计学差异，不同程度肝炎患者肝组织螺杆菌属特异性16 sRNA检出率无统计学差异，HBV DNA阳性者与阴性者H pylori感染率亦无统计学差异，与既往在汉族人群的研究结果不一致[11]，其原因可能与地域、种族、社会经济状况、宿主基因易感性、H pylori存在不同毒力的菌株等因素有关。慢性乙型肝炎患者H pylori阳性率高的原因可能与胃黏膜出现病理变化，破坏了胃黏膜屏障，导致黏膜防御能力下降，为细菌感染创造了条件[22]。有学者发现在小鼠肝组织分离的螺杆菌是引起啮齿类动物慢性肝炎、肝硬变和肝癌发生的病因之一[23]。H pylori是否为慢性乙型肝炎和肝硬化发生的危险因素仍需要大样本、长时间、前瞻性的研究方能得到更有价值的结论。

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（收稿：2015-04-28）

（本文编辑：陈从新）

Helicobacter pylori infection status in Uygur patients with chronic hepatitis B andspecificity 16SrRNA of helicobacter pylori in liver tissues

Wang Xiaozhong，DouYuchang，Wang Yan，etal.Departmentof

Hepatology，Traditional Chinese Medicine Hospital，XinJiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000，Xinjiang Uygur Autonomous Region，China

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.01.008

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（编号:2012211A096）

830000乌鲁木齐市新疆维吾尔自治区中医医院肝病科（王晓忠，王燕，庄小芳）；吉林大学中日联谊医院肝病科（窦逾常）第一作者：王晓忠，男，45岁，医学硕士，主任医师。主要从事病毒性肝炎基础与临床研究。E-mail:wxz125@sina.com

王燕，E-mail:wy751105@126.com