REDE-DHPLC检测NSCLC血浆EGFR突变及其临床意义*

阙　丹，肖　何，陈　川，蓝美玲，李　建，黄　环，赵莲花，肖华亮，王　阁△

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所：1.肿瘤中心;2.病理科,重庆 400042)



论著·临床研究

REDE-DHPLC检测NSCLC血浆EGFR突变及其临床意义*

阙丹1，肖何1，陈川1，蓝美玲1，李建1，黄环1，赵莲花1，肖华亮2，王阁1△

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所：1.肿瘤中心;2.病理科,重庆 400042)

目的探讨酶切富集联合变性高效液相色谱法(REDE-DHPLC)检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血表皮生长因子受体(EGFR)突变的临床应用价值。方法采用REDE-DHPLC法对该院收治的403例NSCLC患者血浆EGFR 19和21外显子突变状态进行检测，分析突变与基线资料的相关性。其中115例患者同时采用ARMS法对肿瘤组织样本进行突变检测，比较两种方法检测的一致性。结果403例患者血浆样本总突变率为26.3%(106/403)。女性、不吸烟、腺癌及晚期(Ⅲb～Ⅳ)患者血浆EGFR突变率分别显著高于男性、吸烟、非腺癌及早期患者(P<0.05)。多变量Logistic分析显示性别、吸烟史及组织类型是血浆EGFR突变的独立预测因素(P<0.05)。115例配对样本中，以组织样本为标准，REDE-DHPLC法检测血浆EGFR突变的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为69.0%、97.3%、93.5%、84.5%，两种检测方法具有较好的一致性(κ=0.702)。 结论性别、吸烟史及组织类型是NSCLC患者血浆EGFR突变的独立预测因素，REDE-DHPLC法检测血浆EGFR突变敏感度及特异度较高。

癌，非小细胞肺；色谱法，高压液相；酶切富集；受体，表皮生长因子

肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占85%[1]，多数患者在确诊时已属晚期，失去手术治疗机会。以酪氨酸激酶抑制剂(TKI)为代表的靶向治疗给临床NSCLC的治疗提供了新的思路，成为近年研究的热点。组织样本是检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变的“金标准”，但多数晚期患者常无法获取满意组织样本用于突变检测。因此，寻找更易获取、方便动态监测的样本对临床具有重要意义。近期，国内外多项临床研究显示外周血EGFR突变与组织样本具有较高的符合率[2-4]，但各检测方法的敏感度和特异度存在一定差异，外周血样本能否替代组织样本用于临床突变检测有待进一步研究。本研究采用酶切富集联合变性高效液相色谱法(restriction endonuclease digestion-denaturing high performance liquid chromatography,REDE-DHPLC)对NSCLC患者血浆EGFR突变进行检测，分析突变与基线资料的相关性，并与配对组织样本检测进行对比分析，探讨REDE-DHPLC法检测血浆EGFR突变与组织检测的一致性。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2012年1月至2014年12月本院肿瘤中心收治的403例NSCLC患者临床资料，其中男282例，女121例，年龄33～86岁，平均(60.5±10.0)岁。患者均经病理确诊为NSCLC。403例患者均在首次入科治疗前采集空腹血浆进行血浆突变检测，其中115例患者在血浆检测同时对穿刺或术后病理标本进行组织突变检测(与血浆检测时间差小于1个月)。403例患者及家属均签署知情同意书。

1.2方法403例NSCLC患者血浆EGFR 19和21外显子突变采用REDE-DHPLC法进行检测，115例配对患者的组织样本采用ARMS法进行检测。EGFR 19和21外显子引物设计参考文献[5]进行。

1.2.1标本收集及DNA提取患者入院后采集空腹外周静脉血4 mL置于EDTA抗凝管中，离心后采用美国QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取游离DNA。从患者石蜡标本中获取5片5 μm厚石蜡标本，使用QIAGEN公司生产的FFEP-DNA Kit试剂盒提取组织DNA样本。

1.2.2REDE-DHPLC法检测血浆检测第一轮PCR扩增体系为25 μL，包括10 ×PCR缓冲液2 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、dNTP(10 μmol/μL)2 μL、上下游引物(10 μmol/μL)各1 μL、模板DNA 2 μL。PCR条件为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72℃ 50 s,共40个循环；72 ℃ 7 min。19外显子为缺失突变(19 Del),将第一轮PCR产物加入含Mse I(美国NEB公司生产)的酶切体系,37 ℃孵育150 min，酶切产物进行第二轮PCR，扩增体系同第一轮PCR，共40循环。产物采用美国Transgenomic公司生产的DNASep柱进行分析。21外显子为置换突变(21 L858R)，将第一轮PCR产物加入含Msc I(美国NEB公司生产)的酶切体系，37 ℃孵育150 min，第二轮PCR产物采用Sau96 I酶切(美国NEB公司生产)，而后产物95 ℃孵化5 min，以1 ℃/min 速度将至35 ℃进行复性。设定DNASep柱缓冲液流速为0.9 mL/min，检测器紫外分光光度计设为260 nm。检测突变图谱见图1。

A：19外显子缺失突变;B：21外显子点突变。

图1REDE-DHPLC法检测血浆样本19、21外显子突变检测结果

1.2.3组织样本ARMS法突变检测组织样本DNA提取后采用ARMS法进行突变检测。试剂盒采用厦门艾德公司研发的人类EGFR基因突变检测试剂盒(ADx-ARMS)，按照提供的判读标准，对组织样本提取的DNA突变情况进行检测，在本院病理科完成。

1.3统计学处理运用 SPSS20.0 统计软件进行数据分析，计数资料用构成比表示，采用χ2检验分析。基线特征与突变率的关系采用χ2检验及Logistic回归分析，一致性分析采用κ检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1患者血浆EGFR突变率比较患者血浆样本总突变率为26.3%(106/403)，其中19和21外显子突变率分别为62.3%(66/106)和 37.7%(40/106)。

2.2血浆EGFR突变与基线特征相关性分析血浆EGFR突变与患者临床基线特征相关性分析显示，女性、不吸烟、腺癌及晚期(Ⅲb～Ⅳ)患者血浆EGFR突变率分别显著高于男性、吸烟、非腺癌及早期(Ⅰa～Ⅲa)患者(P<0.05)，见表1。以单因素分析P<0.01的变量(性别、吸烟史、组织类型及分期)为自变量，以血浆突变状态为因变量进行Logistic多变量逐步向前回归，结果表明，性别、吸烟史及组织类型是NSCLC患者血浆EGFR突变的独立预测因素，见表2。

表1　患者血浆EGFR突变与基线特征的关系(n)

表2　多变量逐步Logistic回归分析结果

2.3配对样本一致性比较115例配对患者中，42例组织检测结果为突变型，其中13例血浆检测结果为野生型；31例血浆检测结果为突变型，其中2例组织检测结果为野生型。以组织检测为标准，REDE-DHPLC法检测血浆样本的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为69.0%、97.3%、93.5%、84.5%，两种检测方法具有较好的一致性(κ=0.702)，见表3。

表3　两种检测方法一致性比较

3　讨　论

大型临床研究均表明，TKI能显著延长EGFR突变NSCLC患者无进展生存期，疗效明显优于化疗方案[6-7]。EGFR基因突变是患者TKI获益的关键，组织样本是突变检测的“金标准”[8]，但大部分NSCLC患者在确诊时已进入晚期，常无法获得足够组织样本进行突变检测。Mok等[6]研究中仅36%患者可提供用于检测突变的组织样本，这导致组织样本突变检测在临床应用中受到一定限制。外周血循环肿瘤DNA主要来源于凋亡坏死和脱落的肿瘤细胞，其遗传特性与肿瘤细胞基因组DNA相同[2]，这为血浆样本用于EGFR突变检测提供了可行性。此外，外周血检测还具有易获取、创伤小、患者易接受、方便动态检测等特点，具有广阔的临床应用前景。

目前，应用于血浆EGFR突变检测的方法包括ARMS法、PCR限制性片段长度多态性分析法、突变富集型PCR、DHPLC法、微数字PCR、荧光定量PCR等[9]。由于纳入患者样本量及基线特征的差异、血样本采集时间的不同、检测方法灵敏度差异等，各检测方法与组织样本检测的一致性为48.2%～92.0%[3-6]。部分方法对仪器和操作要求较高、检测成本高、操作复杂，临床广泛推广仍存在一定困难。DHPLC法具有操作简单、快速、自动化程度高等优点，目前已在临床EGFR突变检测中开展应用，Bai等[5]报道DHPLC法检测血浆EGFR突变的检测限值约为3%。杨卓等[10]采用REDE-DHPLC法对质粒标准品EGFR突变进行检测，发现其检测限值达到0.1%，显著高于传统DHPLC法。本研究结果中，患者血浆样本总突变率为26.3%(106/403)，其中19和21外显子突变率分别为62.3%(66/106)和37.7%(40/106)，与既往报道基本一致[3-5]。研究发现，女性、非吸烟者、肺腺癌及亚洲人种是组织EGFR突变的高发对象[9]。本研究对血浆样本突变分析发现性别、吸烟史及组织类型是患者血浆EGFR突变的独立预测因素，可作为初步判断患者潜在突变的因素。

115例配对样本中，以组织检测为标准，REDE-DHPLC法检测血浆样本的敏感度和特异度分别为69.0%和97.3%，两种方法具有较好的一致性。在42例组织突变样本中，有13例血浆检测为野生型。考虑主要与检测方法灵敏度相关。Liu等[11]采用直接测序法检测患者血浆EGFR突变发现，突变率仅为5.1%，远低于组织样本检测结果。而采用敏感性更高的ARMS法重新检测发现，5例血浆直接测序法阴性患者ARMS法检测为阳性。Rosell等[12]发现，晚期NSCLC患者和低分化癌患者，血浆突变检出率更高，与组织样本检测具有更高一致性，这可能与晚期患者肿瘤负荷较大、低分化肿瘤侵袭性强，更易血性转移相关，提示肿瘤负荷与血浆突变检出率具有相关性。微数字PCR法是以单分子反应为基础的极高选择性检测方法，该技术能够较易实现对单个分子的检测，Yung等[13]报道其检测准确度高达99%以上，但在对12例组织直接测序法检测突变阳性患者的血浆应用微数字PCR检测时仍有1例患者血浆检测阴性，推测肿瘤异质性可能是影响检测结果的因素之一。本研究中，3例组织19 Del患者血浆检测为21 L858R，5例组织21 L858R患者血浆检测为19 Del，可能与肿瘤自身内部、原发灶与外周血液间等存在异质性相关。本研究中，2例(2.7%)组织检测阴性患者血浆检测为突变阳性，这与Li等[14]的报道类似，其研究中4例(80%)组织检测阴性而血浆阳性患者服用TKI后疗效较差，提示该血浆检测阳性结果可能为假阳性。

REDE-DHPLC具有快速、经济、自动化程度高、可高通量检测等优点，与组织EGFR突变检测结果具有较高一致性，可作为临床血浆EGFR突变检测有效方法。

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Detect of plasma EGFR mutations in NSCLC by REDE-DHPLC method and its clinical significance*

QueDan1,XiaoHe1,ChenChuan1,LanMeiling1,LiJian1,HuangHuan1,ZhaoLianhua1,XiaoHualiang2,WangGe1△

(1.TumorCenter;2.DepartmentofPathology，ResearchInstituteofFieldSurgery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

ObjectiveTo investigate the clinical application value of peripheral blood epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in non-small cell lung cancer (NSCLC) detected by the restriction endonuclease digestion combine with denaturing high performance liquid chromatography (REDE-DHPLC).MethodsFour hundred and three patients with NSCLC in our department were detected plasma EGFR mutations for exons 19 and 21 by the REDE-DHPLC method.The relationships of EGFR mutations with the patients′ clinical characteristics at baseline were analyzed.Among 403 patients,115 cases were detected EGFR mutations in tumor tissue by simultaneously adopting the ARMS method.The consistency of the two methods was compared.ResultsThe total activating mutation rate of EGFR was 26.3 %( 106/403) in plasma.The mutation rate in female,non-smoking,adenocarcinoma and stage ⅢB-Ⅳ were significantly higher than that in men,smoking,non-adenocarcinoma and stage ⅠA-ⅢA(P<0.05).The multivariate Logistic analysis results showed that gender,smoking history and histological types were the independent predictors of EGFR mutations in plasma(P<0.05).In the 115 matched samples,taking the tissue samples as standards,the sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of the REDE-DHPLC for detecting EGFR mutation were 69.0%,97.3%,93.5% and 84.5% respectively.The two detection methods had better consistency(κ=0.702,P<0.01).ConclusionGender,smoking history and histological types are the independent predictors of plasma EGFR mutation.REDE-DHPLC has higher sensitivity and higher specificity for detecting plasma EGFR mutation.

carcinoma,non-small-cell lung;chromatography,high pressure liguid;enzyme digestion enrichment;receptor,epidermal growth factor

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.013

吴阶平基金资助项目(320.6750.12228；320.6750.12177)。作者简介：阙丹(1988-)，在读硕士研究生，医师，主要从事肺癌靶向治疗方面研究。△

，Tel:(023)68757617;E-mail:wangge70@hotmail.com。

R734.2

A

1671-8348(2016)13-1767-03

2015-11-21

2016-01-16)