大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建*

赵晓彪，李光耀，刘孟刚，范　霞，陈　平△

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所:1.肝胆外科;2.一室,重庆 400042)



论著·基础研究

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建*

赵晓彪1，李光耀1，刘孟刚1，范霞2，陈平1△

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所:1.肝胆外科;2.一室,重庆 400042)

目的构建Tmub1基因的过表达慢病毒载体(LV-Tmub1)，为研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料。方法化学合成Tmub1基因序列，用BamHI/AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体，PCR产物连接入线性化表达的载体。PCR鉴定引物，再对 PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析。使用构建的LV-Tmnb1，转染293T细胞，荧光法检测构建的慢病毒滴度。结果成功构建了LV-Tmub1，并获得相应的病毒，病毒滴度为 2×108TU/mL。结论LV-Tmub1为进一步研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础。

Tmub1；基因；过表达慢病毒载体；大鼠

Tmub1(transmemebrance and ubiquitin-like domain containing 1) 基因编码的Tmub1 蛋白是一个含有类似泛素结构域的能够在细胞核与细胞质之间穿梭的蛋白质[1-3]；在细胞周期的G0期主要位于肝细胞的细胞质内，在细胞增殖后期的G2～S期则几乎全部穿梭进入肝细胞核内。Della等[4]发现Tmub1蛋白在肝部分切除术后肝再生的过程中明显高表达，它包含有一个跨膜域和一个类似泛素结构的区域(UBL)，该区域包含与UCH、E2和CUE等的反应位点。所以说明它在肝细胞增殖过程中担负着复杂而又重要的功能。本研究构建Tmub1过表达慢病毒载体(LV-Tmub1)，用来转染肝细胞系及注射入实验动物体内，为深入了解Tmub1 基因和蛋白在肝细胞增殖和肝再生过程中的作用及分子生物学机制提供实验基础。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1主要试剂Thermo Fisher Scientific Lipofectamine 2000及Opti-MEM培养基 ，1 kp DNA ladder Marker(Fermentas)，Gibco小牛血清，250 bp DNA ladder Marker(捷瑞生物公司)，琼脂糖(赛百盛公司)，限制性内切酶(NEB) ，In-Fusion®PCR Cloning (Kit clontech)， Primer(捷瑞生物公司)，Plasmid 抽提(Kit Promega)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化)，Taq polymerase(SinoBio)，dNTP(Takara) ，BRL-3A细胞(上海生命科学研究所)。

1.1.2主要仪器Applied Biosystems公司PCR仪，美季生物技术ABI3730 型positive clone 测序仪，BioRad稳压DNA电泳仪，天能公司凝胶成像仪，上海实验设备有限公司细菌摇床，Thermo细菌培养箱，Gibco水浴箱，Gilson移液器，日立高速离心机。

1.2方法

1.2.1目的基因的获取首先在美国国立图书馆查找大鼠Tmub1基因序列，基因编号：362301。PCR扩增目的基因片段(图1)，5′端GGA TCC为BamHI酶切位点，3′端ACC GGT为AgeI酶切位点。其中蓝色标记为美国国立图书馆的大鼠Tmub1基因编码区。

1.2.2酶切载体工具载体购自吉凯基因，载体名称：GV287；10.4 kb；元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP；克隆位点：BamHI/AgeI。酶切反应温度37 ℃，时间2 h。

1.2.3重组质粒构建

1.2.3.1PCR产物交换入线性化表达载体反应条件为25 ℃反应30 min，然后42 ℃反应15 min。

1.2.3.2CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞(1)从新鲜细菌培养平皿中选取一个单菌落，转到含有 100 mL小牛血清培养基的1 L烧瓶中，在37 ℃条件下剧烈振荡摇匀培养3 h。(2)将培养后的大肠埃希菌转移到无菌的60 mL离心管中，在冰上放置10 min，4 000 r/min离心10 min，回收离心后的细胞。(3)缓慢倒出上层培养液，然后用10 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬细胞。(4)在40 ℃条件下，4 000 r/min离心10 min，回收沉淀细胞。(5)倒出培养液，每50 mL初始培养细胞用2 mL用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。

图1　化学合成的基因片段

1.2.3.3转化(1)取200 μL感受态细胞悬液转移到500 μL离心管中，管中各加入10 μL连接溶液，放置冰上30 min。(2)然后将每个离心管放到42 ℃的恒温水浴箱中放置90 s。(3)将离心管快速放置到冰上冷却细胞1～2 min。(3) 每管中各加入 800 μL小牛血清培养基，放置到37 ℃摇床上培养45 min。(4)分别将150 μL已转化的各种感受态细胞转移到AMP抗性的LB琼脂培养基上。(5)将平板置于室温条件下直至液体被完全吸收。(6)倒置培养平皿，于37 ℃细胞培养箱中培养16 h。

1.2.3.4阳性克隆的PCR测定采用20 μL反应体系，取2 μL菌液作为模板，选择合适的引物对其进行PCR扩增，再使用琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。阳性克隆结果测序及分析。

1.2.4慢病毒包装(1)使用2%胰酶消化培养于50 mL培养瓶中对数生长期的293T细胞，DMEM培养基调整细胞密度，光学显微镜下计数，当细胞密度为6×105/mL时将细胞密度重新接种于25 mL细胞培养皿中，37 ℃细胞培养箱中培养24 h后显微镜下观察，待细胞密度达到75%～80%时即可用于转染。(2)灭菌10 mL离心管中加入所制备的各DNA溶液，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，室温下温育5 min。(3) 取200 μL Lipofectamine 2000转染试剂与4.8 mL Opti-MEM培养基混合后在室温下温育 5 min。(4)将Opti-MEM培养基稀释后的DNA溶液与稀释后的Lipofectamine 2000转染试剂充分混合均匀，在室温下温育20 min。(5) 将 DNA溶液与Lipofectamine 2000转染试剂的混合液快速转移至293T细胞的培养液中，充分混合均匀，放置入37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养8 h后倒去含有转染混合物的培养基，各细胞中加入20 mL PBS缓冲液洗涤3次，然后将每瓶细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基25 mL后继续放置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱内培养48 h。

1.2.5病毒的收获及浓缩(1)收集转染培养48 h后的 293T细胞上清液，在4 ℃，4 000 r/min条件下离心10 min后除去下层沉淀，上清液使用0.45 μm过滤器过滤于50 mL超速离心管中得到病毒提样液。(2)将得到的病毒提液样品加入到过滤杯中，然后将过滤杯插到滤过液收集管中，4 000 r/min离心，时间为10～15 min。(3)得到病毒浓缩液后将其分别收集于1.5 mL无菌Ep管中，-80 ℃冰箱保存，随机取出其中一支，进行病毒生物学滴度测定。

1.2.6荧光法慢病毒滴度测定(1) 调整293T细胞浓度为4×105，使用96孔细胞培养板培养细胞，每个孔加体积为100 μL。(2)10个无菌的Ep管中分别加入90 μL无血清的DMEM培养基。(3) 取待测定的病毒原液10 μL加入到第一个Ep管中，标记为1管，2管中的病毒原液比1管稀释10倍，3～10管依次稀释10倍。(4)在96孔培养板中选取所需的细胞孔，吸去其中90 μL培养基后加入90 μL 稀释好的病毒溶液，放入培养箱37 ℃，5%CO2培养24 h后加入完全培养基100 μL继续培养96 h后在荧光显微镜下观察慢病毒荧光表达情况。

2　结　果

2.1阳性克隆结果阳性转化子PCR产物大小921 bp，阴性转化子PCR产物大小185 bp,见图2。

1：阴性对照ddH2O；2：空载自连对照组；3：阳性对照GAPDH；4：Marker，自上而下依次为5.0、3.0、2.0、1.5、1.0 kb，750、500、250、100 bp；5～12：Tmub1基因1～8号转化子。

图2PCR产物电泳图

2.2阳性克隆结果测序同一性为100%，测序结果与目标序列完全一致。

2.3荧光法慢病毒滴度测定结果荧光法测定慢病毒滴度为2×108TU/mL，见图3。

A、B：加入病毒10 μL；C、D：稀释10倍后的荧光表达情况；E、F：稀释105倍后的荧光表达情况。

图3荧光法慢病毒滴度测定(×100)

3　讨　论

慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞具有感染能力，能够稳定的转染多种哺乳动物细胞系和原代细胞[5-8]。目前在实验室和临床前研究中以及临床治疗中已广泛使用。

肝部分切除术后，刺激体内生物信息系统及物理学反馈信号系统使处于静止期的肝细胞分裂，进入增殖周期，此时体内各种细胞因子、生物因子以及多个脏器参与其调控[9]。其中，Tmub1蛋白在肝部分切除术后的肝再生过程中明显高表达，能够在增殖的肝细胞质与细胞核之间穿梭，且具有明显的生物学规律，说明Tmub1蛋白可能在肝细胞增殖过程中发挥作用[10-11]。为了研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用及其分子生物学机制，需要通过现代基因工程学的方法，构建Tmub1基因过表达的慢病毒载体，用来转染肝细胞系及注射肝部分切除术后的大鼠。首先在美国国立图书馆网站查到目标基因大鼠Tmub1序列，然后通过基因扩增技术克隆该目标序列，再利用已有的质粒载体，把Tmub1目标序列整合到该质粒中，所得到的阳性克隆序列经过基因测序与目标序列完全一致。再经过滴度检测及分装保存，收获了Tmub1过表达慢病毒载体。

Tmub1基因过表达慢病毒载体的成功构建，对下一步研究Tmub1基因及蛋白在大鼠肝部分切除术后肝再生和体外BRL-3A肝细胞系增殖中的作用提供实验依据及实验基础，并且为了解生物体内的其他细胞增殖的分子生物学机制提供帮助。通过对其更加深入的研究，还可能为临床预防和治疗肝切除术后肝功能衰竭提供基因治疗的新思路。

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Construction of lentivirus vectors of rat Tmub1 gene overexpression*

ZhaoXiaobiao1,LiGuangyao1,LiuMenggang1,FanXia2,ChenPing1△

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery;2.DepartmentofFirstLaboratory，ResearchInstituteofSurgery，DapingHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042，China)

ObjectiveTo construct the lentiviral vector with overexpression Tmub1 gene to provide the experimental materials in the research of Tmub1 protein function in the process of the hepatocyte proliferation.MethodsThe Tmub1 gene sequences was constructed through chemical synthesis,plasmid containing the purpose gene and GV287 vectors were digested with BamHI/AgeI enzyme,the PCR products were connected into the linearized expression vector.PCR confirmed the primers,the positive clones identified by PCR DNA were sequenced and performed the comparative analysis.The constructed lentiviral vectors of Tmub1 gene overexpression was used to transfect 293T cell lines.Then the lentivirus titer was detected by the fluorescence method.ResultsThe lentiviral vector with Tmub1 gene overexpression was successfully constructed and the corresponding virus was obtained,the virus titer was 2×108TU/mL.ConclusionLV-Tmub1 expressing lentiviral vector provides the experimental foundations for the further study of the role of Tmub1 protein in hepatocyte proliferation.

Tmub1;gene;LV-Tmub1；rats

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.005

国家自然科学基金面上项目(81270523)。作者简介:赵晓彪(1979-)，硕士，主治医师，主要从事肝切除术后肝再生的相关研究。△

，E-mail:chenping@263.com。

R575

A

1671-8348(2016)13-1744-03

2015-11-26

2015-12-30)