载脂蛋白-J质粒转染大鼠BMSCs及其在靶细胞中的表达*

刘学良，彭建华，周　冲，徐　斌，秦兴虎，刘　亮

(西南医科大学附属医院神经外科，四川泸州 646000)



·技术与方法·

载脂蛋白-J质粒转染大鼠BMSCs及其在靶细胞中的表达*

刘学良，彭建华，周冲，徐斌，秦兴虎，刘亮△

(西南医科大学附属医院神经外科，四川泸州 646000)

目的对比pEGFP-N1-apoJ质粒在不同DNA浓度条件下转染骨髓间充质干细胞的转染率，并测定载脂蛋白-J的表达情况。方法0.8、1.2、1.6、2.0 μg pEGFP-N1-apoJ质粒分别在脂质体的介导下转染大鼠骨髓间充质干细胞，并在荧光显微镜下观察，确定24、48、72 h时转染率,筛选出能获得最高转染率的质粒的量。设置pEGFP-N1-apoJ质粒组、空pEGFP-N1质粒组、空白对照组，用蛋白免疫印迹法检测载脂蛋白-J在24、48、72 h 3个时间点的表达情况。结果4个不同质粒浓度组转染率分别为：(16.7±1.0)%、(19.7±1.4)%、(30.1±3.6)%、(21.7±5.5)%，比较4个组间转染效率差异有统计学意义(P<0.05)，且1.6 μg pEGFP-N1-apoJ质粒组转率最高。通过蛋白免疫印迹法检测后，3个目的蛋白灰度值与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)灰度值相比较，蛋白质相对表达水平为：pEGFP-N1-apoJ质粒组1.91±0.12，空pEGFP-N1质粒组0.56±0.11，空白对照组0.57±0.17，差异有统计学意义(P<0.05)。结论质粒pEGFP-N1-apoJ可在脂质体的介导下转染入大鼠骨髓间充质干细胞,携带载脂蛋白-J基因的靶细胞可表达载脂蛋白-J。

载脂蛋白类；间质干细胞；载脂蛋白-J；重组质粒；骨髓间充质干细胞；转染；蛋白免疫印迹法

载脂蛋白J(ApoJ)是一种新型糖蛋白，它是一种分子量为70×103的二聚体蛋白质,广泛分布于人体各种组织,以脑含量最多。相关研究显示ApoJ在多种神经系统疾病中均有高表达[1]。ApoJ功能广泛，在神经系统方面对神经元有保护作用，有利于神经元的可塑性等生理过程[2]。细胞转染技术是采用某种方法和途径将外源分子如DNA、RNA等导入特定的细胞,并表达目的基因，产生特定功能的蛋白质分子。本实验在于不同量质粒pEGFP-N1-apoJ转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)，并检测ApoJ的表达情况，以获得高转染效率，筛选转基因细胞。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1大鼠BMSCs和质粒大鼠BMSCs，由泸州医学院附属医院医学实验中心赠送。含绿色荧光蛋白基因质粒pEGFP-N1-apoJ及空质粒pEGFP-N1，由吉凯基因有限公司提供。

1.1.2主要试剂脂质体LipofectaminTM2000(碧云天) α-MEM培养基,胎牛血清(Gibson公司)；高效RIPA组织/细胞裂解液(solaria);一抗-兔抗鼠ApoJ抗体-Clustering Antibody(Proteintech)；3-磷酸甘油醛脱氢酶(anti-GAPDH)(Proteintech)；二抗-羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Proteintech)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒(solaria)；电泳蛋白彩色预染Marker(thermo);电化学发光(ECL)发光液(Millipore)。

1.2方法

1.2.1细胞的复苏、传代及培养细胞株从液氮中取出后迅速复苏，接种于25 cm2培养瓶，采用全骨髓贴壁培养法培养[3]。待骨髓间充质干细胞(BMSCs)生长至80%～90%融合度时，按1∶2进行传代培养。

1.2.2脂质体介导不同质量的质粒pEGFP-N1-apoJ转染大鼠BMSCs细胞接种到6孔板融合达90%左右时即可进行转染，转染前1 d换液。 转染前用无血清培养基冲洗细胞2遍。准备好灭菌的1.5 mL Eppendorf管，分别将0.8、1.2、1.6、2.0 μg pEGFP-N1-apoJ质粒用α-MEM培养基稀释至200 μL(每管都标为①)，混合均匀。方法同上，将3.0 μL LipofectaminTM2000 用α-MEM培养基稀释至200 μL(每管都标为②),室温条件下孵育5 min。将①号管与②号管中培养基均匀混合，使总体积为400 μL，混合物在室温条件下孵育20 min。转染分为4组(按前文质粒浓度分别为A1、A2、A3、A4组)，每组6孔，将含不同pEGFP-N1-apoJ质粒量的转染复合物分别加入到相对应的孔中转染(并在6孔板上做好标记)；将转染处理过后的细胞置于37 ℃，5%CO2的培养箱中培养，培养5～6 h后更换无双抗含有血清的培养基培养。

1.2.3测定转染效率转染24、48、72 h后将细胞置于荧光显微镜下观察，观察细胞中绿色荧光蛋白表达，在10个细胞分别均匀分布的视野下用100倍镜观察,该孔细胞转染效率为10个视野转染阳性细胞数之和除以细胞总数之和的值。

1.2.4脂质体介导质粒转染大鼠BMSCs转染分为a组、b组和c组(每组6孔)，a组转染质粒pEGFP-N1-apoJ(加入质粒的量与1.2.2实验中转染效率最高组相同)；b组为对照,转染空质粒pEGFP-N1(所用空质粒的量与a组所用质粒的量相同)；c组为空白对照,加入等量的脂质体。余下步骤与1.2.2中均相同。分别在24、48、72 h时间点将各组细胞置于荧光显微镜下观察。

1.2.5蛋白质的提取及蛋白免疫印迹法检测ApoJ的表达分别在转染24、48、72 h 3个时间点,采用标准裂解法[3]提取蛋白。然后，应用Western blot对Apo-J进行检测:检测蛋白浓度，制胶；上样分别加入：Marker，A组、B组和C组的蛋白提取物，行SDS-PAGE蛋白电泳；室温封闭1 h；兔抗鼠ApoJ抗体一抗(1:1 000)4 ℃孵育过夜，羊抗兔IgG二抗(1:1 500)室温孵育2 h，曝光，显影，拍照。内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。根据实验结果重复实验,计算机Quantity-one软件分析灰度值，以目的片段的灰度值与相应GAPDH灰度值的比作为两者蛋白质的相对水平。

2　结　　果

2.1大鼠BMSCs的形态学观察将细胞置于光学显微镜下100倍观察，大鼠BMSCs贴壁生长，形态为多角形和扁平形。细胞复苏后培养4～6 d可达90%左右融合，形态变为长梭形。第3～4代后细胞形态挤压成束状，细胞胞质丰富，核大，核仁明显，细胞形态相对稳定，见图1。

A:4～6 d；B：3～4代。

图1大鼠BMSCs(×50)

A～F、M～R：荧光显微镜观察转染的BMSCs细胞；G～L、S～X：可见光下观察转染的BMSCs细胞。A、G，D、J,M、S，P、V：转染24 h后的观察结果；B、H，E、K，N、T，Q、W：转染48 h后的观察结果；C、I，F、L，O、U，R、X：转染72 h后的观察结果。

图2绿色荧光蛋白在大鼠BMSCs中的表达(×100)

2.2转染后绿色荧光蛋白的观察及转染效率的测定在适宜条件下培养转染细胞，并在24、48、72 h 时间点将细胞置于荧光显微镜100倍下观察各组荧光蛋白的表达情况，各组间表达绿色荧光蛋白的阳性细胞在数量上存在着差异(图2)。3.0 L LipofectaminTM2000脂质体分别与0.8、1.2和1.6 μg pGFP-N1-apoJ质粒混合作用转染后，表达绿色荧光蛋白的阳性细胞数逐渐增多，脂质体与1.6 μg pEGFP-N1-apoJ质粒转染后绿色荧光蛋白表达最多，分别在3个时间段获得最高的转染效率27.8%、28.2%、34.3%。当参与转染的pGFP-N1-apoJ质粒量增加到2.0 μg时，表达阳性细胞的数没有提高，表现出降低的趋势(图3)。不同质粒浓度组间的转染效率不全相同，分别为A1组[(16.7±1.0)%]、A2组[(19.7±1.4)%]、A3组[(30.1±3.6)%]、A4组[(21.7±5.5)%]，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3最佳浓度重组质粒及空质粒转染大鼠BMSCs后观察采用3.0 μL脂质体与1.6 μg的重组质粒及空质粒配制成复合物进行转染后分别在24、48、72 h 后在荧光显微镜下观察各组细胞荧光的表达情况，见图4。

图3　　质粒转染大鼠BMSCs的转染效率

2.4ApoJ表达情况分析Western blot法检测到在24、48、72 h 3个时间点，a组在相对分子质量70×103处可见大量ApoJ表达，b组及c组见微量ApoJ表达，差异有统计学意义(F=215.646，P<0.05)；各组蛋白质相对表达水平分别为：a组1.91±0.12、b组0.56±0.11、c组0.57±0.17，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5～7。

A～F：荧光显微镜观察转染的BMSCs细胞；G～L：可见光下观察转染的BMSCs细胞；A、G、D、J：转染24 h后的观察结果；B、H、E、K：转染48 h后的观察结果；C、I、F、L：转染72 h后的观察结果。

图4最佳浓度质粒及空质粒转染大鼠BMSCs，绿色荧光融合蛋白的表达(×100)

图5　　Western blot检测转染24 h后ApoJ表达

图6　　Western blot检测转染48 h后ApoJ表达

图7　　Western blot检测转染72 h后ApoJ表达

3　讨　　论

BMSCs在骨髓组织中含量最为丰富，它作为干细胞具有多向分化的潜能[4-5]。BMSCs具有易获得、低免疫原性等特性，在良好的培养条件下可以诱导分化为特定类型和有功能的神经元并且通过独立的调节机制完成向神经元分化[6-9]，以及容易被外源基因转染并能相对稳定表达目的蛋白，所以它可以被作为一种良好介质应用于基因及细胞治疗等方面[10-11]。脂质体水相内核是由磷脂双层构的[12-13]，脂质体介导的转染具有以下优点[14]。操作简单、安全性高，能够感染分裂细胞也能感染非分裂细胞，携带外源基因大小不受限制等特点。基于这些优势脂质体被选为基因转染的载体。

该实验证明携带相关基因的质粒能够在脂质体的介导下对大鼠BMSCs能进行转染。通过该实验可以发现影响脂质体转染因素主要有质粒的浓度、脂质体浓度、孵育时间等，其中质粒浓度尤为关键。探索并优化转染条件后发现，质粒浓度过低时，转染效率低，而浓度过高时，转染效率反而降低。当质粒浓度低时，脂质体不能充分有效的携带质粒进行转染，故转染效率低；当质粒浓度过高时，容易增加细胞毒性导致细胞死亡，转染效率也低[15]。合适的质粒和脂质体比例下，脂质体可高效的介导外源性质粒基因转染BMSCs。与此同时本实验说明BMSCs成功地与携带Apo-J外源性基因的质粒结合后能有效的表达目的蛋白。为进一步探索携载脂蛋白-J基因BMSCs的后续基因工程相关实验奠定了基础。

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The expression of Apo-J plasmid of target cells in rat bone marrow mesenchymal stem after transfection*

LiuXueliang,PengJianhua,ZhouChong，XuBin,QinXinghu,LiuLiang△

(DepartmentofNeurosurgery,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo compare the transfection efficiency of BMSCs transfected with pEGFP-N1-apoJ plasmid in different DNA concentration,and the expression of Apo-J was determined.MethodsThe pEGFP-N1-apoJ plasmid was transfected into BMSCs by Liposome which the quality respective is 0.8,1.2,1.6,2.0 μg respectively,and we observed by fluorescence microscope,determined the transfection efficiency at 24,48,72 h,and screened out the amount of plasmid that could get the highest transfection efficiency.Then we set pEGFP-N1-apoJ plasmid group,empty pEGFP-N1 plasmid group,blank control group.The expression of Apo-J at 3 time points was detected by Western blot.ResultsThe transfection efficiency of 4 different plasmid concentration groups were:(16.7±1.0)%,(19.7±1.4)%,(30.1±3.6)%,(21.7±5.5)%.There was significant difference in transfection efficiency among 4 groups(P<0.05).And the transfection rate of the 1.6 μg pEGFP-N1-apoJ plasmid group was the highest.After the detection by Western blot,the relative expression level of protein was as follow:PEGFP-N1-apoJ plasmid group 1.91±0.12,empty pEGFP-N1 plasmid group 0.56±0.11,blank control group 0.57±0.17,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionPlasmid pEGFP-N1-apoJ might be transfected into rat BMSCs by liposome.The target cells carrying the Apo-J gene can express Apo -J.

apolipoproteins；mesenchymal stem cells；apolipoprotein-J；recombinant plasmid；BMSCs;transfection；Western blot

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.022

四川省教育厅重点项目课题(12ZA075)；泸州市科技局课题(2011-I-S45)。 作者简介：刘学良(1986-)，住院医师，硕士，主要从事中枢神经系统损伤与肿瘤研究。△

，E-mail:liust@163.com。

Q782

A

1671-8348(2016)14-1942-03

2015-11-15

2016-01-31)