采用蚕豆根尖细胞微核技术检测核设施周围水域的遗传毒性

2016-09-02周银行

癌变·畸变·突变 2016年2期

邓　冰，穆　龙，周银行

邓冰，穆龙，周银行

（中国工程物理研究院核物理与化学研究所，四川绵阳621900）

目的：利用蚕豆根尖细胞微核技术对核设施周围水域的水质污染情况进行检测。方法：分别于芙蓉溪桥河水、涪江河水、安昌河水等7个位点进行水样采集，以采集水样直接处理蚕豆根尖，测定各采样点水样的蚕豆根尖微核率(MNF)及污染指数(PI)和放射性水平，并进行了统计分析。结果：各采样点放射性污染水平均低于国家标准限值，但各采样点的MNF有显著差异，7个采样点中有5个采样点的PI在2以上，和对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。结论：核设施周围水域污染主要是由两岸工业、生活和垃圾等排污引起，核设施运行所产生的放射性流出物对公众和环境的影响轻微。

蚕豆根尖细胞；微核率；水体污染指数；核设施

【ABSTRACT】OBJECTIVE: The micronucleus test with Vicia faba root tip cells was used to study genotoxicity of pollutants from rivers around nuclear facilities. METHODS：7 samples collected from river of Furong bridge，Fujiang，Anchang，etc. were used to treat V. faba root tip cells directly. Micronuclei frequencies (MNF) and proliferation index (PI) were determined and statistics analyses were performed to evaluate the difference in MNF among different samples. RESULTS：There was significant differences in MNF for every site. PI values of 5 sites among 7 sampled sites were over 2，and it is highly significant compared with the contrast one (P＜0.01). CONCLUSION：The results show that the sampling points of radiation pollution levels were lower than the national standard limit value. However，water pollution of the rivers around the nuclear facilities was mainly caused by cross-strait industrial，life，and gabage pollution. Radioactive effluent generated by nuclear facilities operation affected the public and the environment lightly.

【KEY WORDS】Vicia faba root tip cell；micronucleus frequency；water pollution index；nuclear facilite

辐射环境监测是从半个世纪前起步，伴随着核污染事件、核泄露事故的发生，公众的心理变化和关注而发展，世界上许多国家如美国、日本、英国、法国等一些发达国家建立了核设施环境辐射连续监测系统，用于核事故的早期报警及事故监测，其监测数据成为安抚公众、当局决策的主要依据。我国环境辐射监测工作自上世纪五十年代起步，近年来随着核电站的兴建及发展正逐步受到核电、环保等有关部门的重视，国家环境保护规划中也明确将核安全和辐射环境监测管理列为主要任务之一，建立和完善核安全、辐射防护与应急、放射性废物管理的法规和标准，制订《放射性污染防治法》和《核安全法》，从而从法律和制度上确保了核设施周围辐射环境监测的重要性。核设施在正常的运行条件下，释放到环境中的放射性物质通过各种途径导致对人的照射，对当地居民产生附加剂量。评价个体和群体接受的剂量时，必须考虑到所有重要的照射途径。但是，在放射性核素常规释放的大多数情况下，环境介质中的放射性核素活度浓度都低于探测限值，因而仅仅通过环境监测不能够计算出照射剂量。因而通过常规的理化方法监测不能够充分反映核设施周围水体多种化学元素、核素混合暴露的健康风险。

蚕豆(Vicia faba)根尖细胞微核试验技术是一种以染色体损伤及纺锤丝毒性等为测试终点的植物微核检测方法[1]，它具有简便、快速、灵敏高等优点。微核是染色体产生的断裂片段，在细胞间期独立于正常核而存在的微小的具有核形态的结构。当外界环境中存在一定浓度的致突变物时，可使细胞发生损伤，从而使有微核的细胞增多，即微核细胞率上升，微核试验是监测致突变性污染的一种经济快速方法。致突变性和致癌高度相关，致突变污染物中可能存在致癌危险物。目前，微核实验已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。研究表明，以植物进行微核测试和动物的一致率可达99%以上。我国已将这一技术列为水质污染的规范检测方法之一，已在环境监测、化学物质致突变性检测等方面得到了广泛的运用[2-4]。目前已用于河流水质遗传毒性评价的短期生物毒性实验，在检测水质遗传毒性时，均需对水样进行漫长、昂贵的浓缩过程。而采用植物遗传毒性实验具有可原位监测环境混合物毒效应的优点。本研究通过采用蚕豆根尖微核实验分析核设施周围河流的遗传毒性，探讨蚕豆根尖微核实验应用于核设施周围河流遗传毒性原位监测的可行性。

1　材料与方法

1.1实验材料

松滋青皮豆，购自华中师范大学生命科学学院。其他常用试剂均为化学纯，购自Sigma公司。

1.2采样点的布设依据和水样采集

中国工程物理研究院(下称“中物院”)科研基地主体集中于四川省绵阳市科学城。中物院核设施和放射性操作场所的自然环境特征是地属中亚热带湿润季风气候，雨量丰富，降水主要集中在6—9月。场址多位于龙门山脉，从区域上看，NE向的龙门山断裂是我国地壳变形最强裂岩石破碎度最强的构造带之一。绵阳市的社会环境特征是市、县、乡镇所在地和大、中型企事业单位生活区人口稠密，河川地区为农业区，人口比较集中。在场址地区河谷地和台阶有一些农田。中物院涉及核设施、放射性物质操作和从事辐射研究的区域主要有3个：科学城城区、二所老点、Nuclear Plant(NP)厂区。其设施有：①反应堆；②放射性材料研究设施；③放射化学实验室；④放射性同位素生产；⑤氚靶研制与制备、中子发生器等；⑥放射性废物管理；⑦辐射源(电子加速器、钴源辐照装置、各类密封放射源及开放型反射性物质)。液态流出物经特排输送至废水处理站处理，处理达标后集中于排放槽定期或在丰水期排放。运行期间环境监测布的点是按照通常的环境监测布点原则进行的，同时考虑气象条件、周围地形、地貌、交通、水系和居民点等因素。共8个采样点，每个采样点断面设置左、中、右3个取样点，采一个混合水样。每断面采水样1 000 mL于塑料瓶内，放于4 ℃冰箱中避光保存备用。采样与监测时间是2015年9月。

饮用水取样布点示意图见图1。饮用水在实验中作为对照组。地表水取样布点如示意图2所示的7个取样点。分别位于新桥芙蓉溪桥下游10 m处河水、铁路桥下涪江水文站下游50 m处河水、东方红大桥下游20 m处河水、安昌河水文站上游40 m处河水、三江总排口下游200 m处河水、老点排放口下游5 m处河水以及老点三区滨河桥下游5 m处河水。地表水化学检测包括pH值、化学需氧量、氨氮、高锰酸盐指数、溶解氧这5项指标。饮用水化学检测包括pH、总硬度、挥发酚、硫酸盐、氰化物、氯化物在内的28项指标。

图1　839水厂出厂水采样布点图

图2　铁路桥下涪江水文站处布点示意图

1.3水中放射性物质检测方法

饮用水中总α和总β的测量根据GB/T 5750.13-2006中的残渣测量法[5]进行，HTO的测量根据GB 12375-1990中的直接测量法[6]进行；地表水中总α的测量根据测量EJ/T 1075-1998的厚源法[7]进行，总β的测量根据EJ/T 900-94中的蒸发法[8]进行，137Cs的测量根据GB 11713-1989的残渣测量法[9]进行，HTO的测量用饮用水。

1.4蚕豆根尖细胞微核实验方法

1.4.1浸种先将松滋青皮豆种子洗干净，按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯中，置25 ℃的温箱内浸泡24～36 h，此期间至少换水两次。待种子吸涨后，将其放入铺有薄层湿润脱脂棉的平皿内，在25 ℃的温箱中催芽36～48 h，其间换水2～3次，待大部分种子初生根长至1.5～2 cm，根毛发育良好时，可用来检测水样的诱变效应。

1.4.2染毒每一处理组选取4粒初生根尖生长良好、根长较一致的种子，放入盛有被测液即核设施周围水域不同采样点水样的培养皿中，让被测液浸泡住根尖即可，处理时间为5 h，另设蒸馏水为对照组。

1.4.3根尖细胞修复培养将处理后的种子，用蒸馏水浸洗3次，每次2～3 min；洗净的种子再放入新铺好纱布的铝盒内，按1.4.1中的培养条件使根尖细胞修复22～24 h。

1.4.4根尖细胞固定将修复培养后的豆子，从根尖顶端切下1 cm长的幼根放入空青霉素瓶中，加入卡诺氏固定液固定24～48 h。

1.4.5孚尔根(Feulgen)染色固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗2次，每次5 min。吸净蒸馏水，再加入5 mol/L HCl将幼根泡住，连瓶放入28 ℃水浴锅中水解幼根15 min左右，视根软化程度可适当增减时间，当幼根被软化即可。

取根尖前端2～3 mm分生组织区置于载玻片上，染色5 min后压片，镜检观察。

1.5镜检与微核千分率、污染指数的计算

微核识别标准：凡是主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核；小核着色与主核相当或稍浅；小核形态可为圆形、椭圆形、不规则形等。每一处理观察3个根尖，每个根尖计数至少1 000个细胞中的微核数，计算微核率(micronucleus frequency，MNF)，MNF用千分率表示。在计数微核的同时，计数有丝分裂的细胞数，计算污染指数(pollution index，PI)。

MNF=含MN的细胞数/观察的细胞数×1 000‰；

PI=样点的MNF均值/对照组的MNF均值

对于各原水样品，在进行统计学处理的同时，我们使用污染指数(PI)来划分污染程度。PI在[0，1.5]区间为基本无污染；(1.5，2]区间为轻度污染；(2，3.5]区间为中度污染；(3.5，+∝)区间为严重污染。此法可避免因实验条件等因素带来的MNF本底的波动。

1.6统计学方法

实验结果利用 SPSS 13.0 统计软件进行分析，采用Dunnett’s t检验对各染毒组与对照组之间的 MNF、PI进行统计检验，以α=0.05为检验水准。

2　结果

2.1饮用水、地表水放射性检测结果

水中放射性检测，包括总α、总β、氚检测及137Cs的化学分析。在各采样点分别采集饮用水和地表水共8个样品进行放射性水平检测，结果表明饮用水和地表水中总α、总β浓度均未超过GB 5749-2006规定的标准限值，HTO浓度均处于较低的水平范围。地表水中均未检出人工核素137Cs。

放射性流出物检测和评价结果表明，中物院从事放射性物质操作和辐射研究的核设施及场所运行情况良好，环境保护有效，放射性流出物对公众和环境无显著影响。

2.2核设施周围水样对蚕豆根尖细胞微核的诱导效应

2.2.1镜检结果从图3可知，以核设施周围水域不同采样点水样处理蚕豆根尖后，不仅可诱导根尖细胞形成微核，同时还观测到核异常的现象，如核质外凸、双核等。

图3　核设施周围水样诱发蚕豆根尖微核

2.2.2数据统计分析结果[10]如表1和表2所示。核设施周围水域不同取样点水样对蚕豆根尖细胞微核的诱导随采样点不同而存在差异。所有取样点水域处理蚕豆根尖细胞后的微核率在5.61‰～18.27‰，其中安昌河水文站样点水样可诱导蚕豆根尖细胞微核率显著增加(PI＞5)，与对照水样比较差异有统计学意义(P＜0. 01)。结果表明，核设施周围水域部分水样具有核损伤作用，产生相应的遗传诱变效应，造成不可逆的遗传损伤。

从表2可知，核设施周围水域的水质存在各地段均受到不同程度的污染，多数断面水质属于中度污染，其中安昌河水样的微核率高达18.27‰，为重度污染。综合表1和表2可知，流经中心市区地带的水体污染加重，而其污染的形成与核设施的运行无关，其主要原因是，当河水自西向东穿城区而过时，受沿途两岸工业、生活和垃圾等排污的影响，致使水体污染沿程加重，直至出市区后，由于水体自净作用能力，下游三江大坝断面污染略有缓解。研究表明涪江中段已受到不同程度的污染，水样对遗传物质产生损伤可形成较高的微核率。

表1　核设施周围饮用水、地表水各检测断面的微核千分率(MNF)及污染指数(PI)

表2　微核千分率的方差分析

3　讨论

中物院建院50多年来，在确保完成国防科研生产任务的同时，我院将军工技术扩展到国民经济和社会生活的许多领域，设计核技术应用、材料、信息、精细化工、环境保护、石油探井、计算机控制等诸多方面。由于中物院工作特点，目前，全院从事放射性作业的设施和场所种类较多、地点分散，其放射性流出物源项较弱，且多为间断排放。分析核设施周围水域的放射性水平，可知，包括地表水和饮用水在内的8个水样的放射性浓度均低于国标限值，因此不会造成本文实验中所采用方法的蚕豆根尖细胞微核。但分析实验结果可知，7个采样点水样与对照组比较，所致蚕豆根尖细胞微核率显著升高，污染指数均在1.5以上，说明相应河段水质都存在除放射性污染以外，不同程度的致突变的其他有毒物污染。也表明直接用采样点水样对蚕豆进行处理，获得淡水水域污染结果明显，应用微核技术进行检测，方法简单，结果灵敏可靠与河段同期的水化学监测资料相比，微核检测评价结果与样品化学污染检测结果基本一致。一般认为化学检测结果是以各项污染物参数指标为主，难以反映这些污染物对生物的综合毒性效应，而本方法可以直接显示河水中的有害物对生物遗传物质的毒性危害，在一定程度上弥补了化学分析的不足。此外，增强核设施周围水域水质的物化和生物检测，及时掌握水质变化的动态规律，可有效防范核设施运行可能产生的污水和生活污水中的致突变物对农田生态系统的破坏以及对水体生物及人类健康造成潜在的威胁[11]。

由于受试验条件和时间限制，本次研究随机瞬时采样，由于水样中浮游藻类和微生物群落的数量变化受营养盐、温度、光照及流域水文条件及季节等因素的影响，因此，细胞微核试验结果只能在一定程度上反映流域境内水环境质量，而不能完全客观地评价各流域水环境污染现状，有待进一步深入研究。

目前，水环境污染监测主要使用化学监测法，其主要优点是可以详细报告水体中所含污染物质的种类和数量。但由于核工业科研院所放射性流出物排放的特点是污染源强度弱、排放间断，但排放源分散且涉及的放射性核素种类复杂，因此取样监测的范围较宽。这一点特别容易造成流出物监测的顾此失彼，尤其是异常排放下的适时监测难度较大。微核试验法所得的结果反映的，则是各种因素综合的遗传毒性效应，其优点除灵敏高、可靠性和实用性强，无需昂贵仪器和深奥技术，实验周期短，条件易控制，取材简便，不受季节及气候条件限制，便于开展实验室监测等以外，还可以反映出化学法所不能表现出的各污染因子拮抗或叠加效应，反映出的遗传毒性是根据真核

细胞DNA 损伤试验得出的，因而对人类自身有更好的可比性。一直以来，河流水质的监督监测主要采用常规的物理和化学监测方法，理化方法虽能精确分析废水的污染成分，但不能直接反映出水质污染后可能引起的生物学效应及污染物质长期的潜在危害性，尤其是污染物质的遗传毒性。对于污染成分复杂的河流水，单用理化指标往往难以全面反映其污染程度，而物理和化学因素诱发微核的剂量与效应及微核率与畸变率间的相关性非常显著，因此，微核试验法和化学监测法配合使用可以为全面评估核设施附近水域水质污染程度和可能产生的遗传效应提供依据。

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[8] 中国核工业总公司安防环保卫生局. EJ/T 900-94 水中总β放射性测定：蒸发法[S]. 北京：中国标准出版社，1994：1-4.

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Use of the Vicia foba root tip micronucleus test to monitor genotoxicity of river samples from around nuclear facilities

DENG Bing，MU Long，ZHOU Yinhang
(Institute of Nuclear Physics and Chemistry, China Academy of Engineering Physics, Mianyang 621900, Sichuan, China)