GJB2基因多态性与汉族人群职业噪声性听力损失相关性的研究

于德财，苗　龙，杨文文，张　娟，尹立红，浦跃朴

GJB2基因多态性与汉族人群职业噪声性听力损失相关性的研究

于德财，苗龙，杨文文，张娟，尹立红，浦跃朴*

（东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，江苏南京210009）

目的： 探讨缝隙连接蛋白beta2(GJB2)基因rs2274083、rs2274084和rs72474224位点多态性与汉族人群职业噪声性听力损失易感性之间的关系。方法：应用1∶1病例-对照研究，病例组177例为电测听结果双耳高频平均听阈≥40 dB的在岗工人，对照组177例为年龄、性别、作业工龄与病例组相匹配，并且电测听结果双耳高频平均听阈＜25 dB的同岗位轮班工人。采用PCR扩增177对样本目的基因片段，对目的基因片段进行测序，确定待研究位点的基因型。结果：GJB2基因的rs2274084位点C、T等位基因频率在病例组和对照组中分布分别为73.73%、26.27% 和63.84%、36.16%，其中CC、TC、TT基因型在病例组和对照组中的分布分别为55.37%、36.72%、7.91%和40.11%、47.46%、12.43%。该位点的基因型频率与等位基因频率在病例与对照组之间的差异均具有统计学意义(P＜0.05)。rs2274083和rs72474224位点基因型分布在病例与对照组间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论：GJB2 rs2274084可能是汉族人群职业噪声性听力损失的易感基因位点，携带C等位基因的工人，暴露职业噪声时更易发生听力损失。

噪声性耳聋；多态性；易感基因；缝隙连接蛋白beta2

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate whether any of the three polymorphisms (rs2274083，rs2274084，rs72474224) of GJB2 are associated with susceptibility to occupational noise-induced hearing loss in Chinese Han population. METHODS：A 1∶1 case-control study was conducted using 177 cases with average hearing threshold of no less than 40 dB in high frequency and 177 controls with average hearing threshold of less than 25 dB in high frequency. Controls were matched with cases according to gender，age，duration of noise exposure and working positions. The genotypes were sequenced after polymerase chain reaction. RESULTS：There was statistically significant differences in the distribution of genotypes and alleles frequencies of rs2274084 between cases and controls. The rs2274084 C and T allele frequencies in cases and controls were 73.73%，26.27% and 63.84%，36.16%. The CC genotypes，TC genotypes，TT genotypes in cases and controls were 55.37%，36.72%，7.91% and 40.11%，47.46%，12.43% respectively. There was no statistically significant difference in the distribution of genotypes of rs2274083 and rs7274224 between cases and controls. CONCLUSION：The data suggest that GJB2 rs2274084 might be the susceptibility gene locus of noise-induced hearing loss in Chinese workers. In addition，workers with the C genotype in rs2274084 might be susceptible to noise-induced hearing loss.

【KEY WORDS】noise-induced deafness；polymorphism；susceptibility gene；gap junction protein beta 2

职业性噪声听力损失(noise-induced hearing loss，NIHL)是全球范围内最严重的职业危害之一，职业性噪声听力损失占到全球范围内成人听力损失的16%，仅次于老年性耳聋，其中发展中国家明显高于发达国家[1]。在相同的噪声环境暴露相同时间的人群，仅有部分人发生听力损失，并且发生听力损失严重程度不同，提示噪声性听力损失存在个体易感性[2]。

目前关于噪声性听力损失易感基因的研究主要包括氧化应激类基因、钾离子循环通道基因、单基因性耳聋基因[3]。已经确认的耳聋相关基因有钙黏蛋白23基因(CDH23)、质膜Ca2+-ATP酶2基因(PMCA2)、氧化性应激基因家族(GSTT1、GSTM1、GSTP1、SOD1、SOD2、CAT等)、钾离子循环有关基因(KCNQ4、KCNE1等)、热休克蛋白70基因(HSP70)等[3]。

缝隙连接蛋白beta2(gap junction protein beta 2，GJB2)基因是近年来听力损失相关研究的热点基因[4-6]。GJB2基因参与内耳钾离子循环，对于维持内耳离子稳态平衡起着重要作用，如果钾离子通道及相关协同转运蛋白发生改变，可以导致内耳钾离子转运机制紊乱进而出现听力损伤[7-9]。本课题组已跟踪研究GJB2 rs3751385多态性与噪声性听力损失的相关关系，研究结果显示，GJB2 rs3751385位点多态性与汉族人群噪声性听力损失存在相关性[10]。rs3751385位点位于启动子区域，可能通过调控GJB2基因的表达来影响听力。本次研究扩大样本后选择了位于GJB2基因编码区域的多态位点rs2274083、rs2274084和rs72474224进行研究，其中rs72474224与噪声性听力损失的研究国内外鲜有报道，故本研究旨在探讨此3个亚洲人特有的多态性及其与汉族人群噪声性听力损失之间的相关关系。

1　对象与方法

1.1研究对象

以统一的纳入标准选择某汽车制造企业和某轨道交通车辆厂的噪声暴露工人作为研究对象。研究对象纳入标准为：汉族在岗接噪工人，无中耳炎、颅脑损伤等既往病史，无耳毒性药物服用史，无家族性耳聋史及爆震性耳聋史。依据《GBZ 49-2007 职业性听力损失诊断标准》对职业性听力损失进行诊断，双耳高频(3 000、4 000、6 000 Hz)平均听阈≥40 dB的工人作为病例组，对照组选择与病例组相同作业岗位，双耳高频平均听阈值＜25 dB的工人，按相同性别、相似年龄(±5岁)、相似接噪工龄(±3 a)进行1∶1配对。符合标准的研究病例是177例，对照177例。

1.2基因分型

提取研究对象的外周血2 mL，用红细胞裂解法提取白细胞，-80 ℃保存备用。利用天根DNA提取试剂盒提取白细胞中DNA。提取的DNA利用紫外分光光度计测定浓度和纯度。选择D(260)/D(280)在1.8～2.0之间的样本进行下一步实验。

由于3个多态位点在基因上的位置比较接近，所以对样本目的多态位点设计引物并进行PCR扩增。引物序列为：上游引物，5´-AAGCCGTCGTACATGACAT AGA-3´；下游引物，5´-CCCAGAGTAGAAGATGGATT G-3´。扩增体系为25 μL：DNA模板30 ng，PCR buffer缓冲液(含Mg2+)4 μL，脱氧核糖核苷酸(dNTPs)1.6 μL，正反引物各0.4 μL(10 μmol/L)，DNA聚合酶0.2 μL (1U)，无酶水补齐。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。最后72 ℃继续延伸5 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳测定，对扩增成功的样品，送金开瑞公司测序，确定目的位点的基因型。

1.3数据分析

SNP位点进行分析的前提是基因型数据符合Hardy-Weinberg平衡，如果不平衡，说明样本选择不具有代表性，不能用于后续分析。本研究在统计分析之前对基因型频率分布进行了Hardy-Weinberg平衡检验，检验水准α=0.05。数据运用SPSS 19.0统计软件分析，对3个位点的各基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布频率进行卡方检验。使用Logistic回归分析，计算多态位点基因型的OR值，分析不同基因型患噪声性听力损失的危险度，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1样本一般人口学特征

按照纳入与排除标准，经过筛选，一共纳入研究对象177对，其中男性173对，女性4对，方差齐性检验结果显示两组样本来自同一总体。病例组的年龄分布为(41.68±8.94)岁，对照组的年龄分布为(41.89± 8.54)岁，年龄分布在两组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。病例组的接噪工龄分布为(17.51±11.05) a，对照组的接噪工龄分布为(18.32±10.32) a，接噪工龄分布在两组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2GJB2基因型测序

GJB2基因采用正向测序，rs2274083位点基因型包括突变纯合型CC(A1)，突变杂合型TC(A2)和野生型TT(A3)。rs2274084位点基因型包括突变纯合型TT(B1)，突变杂合型TC(B2)和野生型CC(B3)。rs72474224位点基因型包括突变纯合型TT(C1)，突变杂合型TC(C2)和野生型CC(C3)。如图1所示。

2.3GJB2基因多态性与噪声性听力损失分析

对照组基因型进行遗传平衡性检验，结果显示该基因3个多态位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。GJB2基因多态位点的基因型频率与等位基因频率在病例组与对照组中的分布如表1中所示。

图1　GJB2基因rs2274083、rs2274084、rs72474224多态位点测序结果

rs2274083位点T、C等位基因在病例组中的分布分别为79.94%、20.06%，在对照组中分别为72.88%、27.12%，该位点等位基因频率在病例组和对照组间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。TT、TC、CC基因型在病例组中的分布分别为64.98%、29.94%、5.08%，在对照组中分别为54.8%、36.16%、9.04%，基因型频率在病例与对照组间的分布差异无统计学意义(P＞0.05)。

rs2274084位点T、C等位基因在病例组中的分布分别为26.27%、73.73%，在对照组中分别为36.16%、63.84%。TT、TC、CC基因型在病例组中的分布分别为7.91%、36.72%、55.37%，在对照组中分别为12.43%、47.46%、40.11%。该位点等位基因频率与基因型频率在病例组和对照组间的分布差异均存在统计学意义(P＜0.05)。携带CC基因型个体比携带TT基因型个体更容易发生噪声性听力损失(OR=2.17，95%CI=1.04～4.53)。

rs72474224位点T、C等位基因频率在病例组中的分布分别是7.91%、92.09%，在对照组中分别为3.67%、96.33%，该位点等位基因频率在病例组和对照组间的差异存在统计学意义(χ2=5.83，P＜0.05)。TT、TC、CC基因型在病例组中的分布分别为2.26%、11.3%、86.44%，在对照组中分别为0、7.34%、9 2.66%。基因型频率在两组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。

3　讨论

GJB2基因编码的蛋白属于缝隙连接蛋白家族，与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道，是电解质、第二信使和代谢产物在细胞间转换的重要通道[11-14]。本研究中GJB2基因3个位点的多态性为亚洲人群多见，其他种族鲜有，通过HapMap中查得rs2274083 T、C等位基因在亚洲汉族人群中的分布频率为71.1%、28.9%。rs2274084 C、T等位基因在亚洲汉族人群中的分布频率为63.95%、36.05%。rs72474224 C、T等位基因频率在汉族人群中的分布频率为95%、5%。3个多态位点的多态性在欧洲人群和非洲人群中均不存在。提示该3个位点多态性存在种族性差异，本研究对GJB2基因多态位点rs2274083、rs2274084和rs72474224进行基因型分型，探讨基因多态性与噪声性听力损失的相关性，对于筛查汉族人群噪声作业易感基因有重要意义。

有研究表明，GJB2 rs2274084位点多态性与非综合征型耳聋存在相关性[15]。本研究结果显示，rs2274084位点的基因型频率与等位基因频率在病例组和对照组间存在统计学差异(P＜0.05)。在相同的噪声暴露前提下，rs2274084位点的CC基因型个体比TT基因型个体更容易发生噪声性听力损失(OR值为2.82，1.27～6.28)。rs2274084 CC基因型可能是噪声性听力损失的易感基因型，研究结果与先前研究一致[15]。GJB2 c.235delC突变是非综合征型耳聋的已确认的热点突变[16，19]，rs2274084位于该突变位点下游155 bp，位于GJB2外显子区域，为非同义突变。有研究表明，外显子区域多态位点的改变可能导致原编码产物的生物学功能降低或消失[17]，该位点多态性可能改变了原编码产物的生物学功能，从而影响了听力。

多项研究也证明GJB2基因多态性与非综合征型听力损失存在相关性[18-20]。Jiang等[19]以176例非综合征型耳聋患者为研究对象，探讨了GJB2基因突变在浙江地区耳聋病人间的分布，共发现了14个不同的突变，其中包括2个新突变位点，最常见的突变是GJB2 c.235delC。Grillo等[20]以122例耳聋患者和132例对照作为研究对象进行病例对照研究，探讨GJB2基因编码区多态位点与耳聋之间的相关性。研究结果显示，多个多态位点(rs3751385、rs7994748、 rs7329857、rs7987302、rs945369、rs7333214)的等位基因频率在病例组与对照组之间存在着统计学差异。以上研究均表明，GJB2基因多态位点在非综合征型耳聋的发生发展中起着重要作用。

综上所述，缝隙连接蛋白GJB2基因rs2274084位点多态性很可能与汉族人群噪声性听力损失易感性存在着相关，机制需要进一步的研究。

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Association between GJB2 genetic polymorphisms and occupational hearing loss in Chinese Han population

YU Decai，MIAO Long，YANG Wenwen，ZHANG Juan，YIN Lihong，PU Yuepu*
(Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu, China)

R994.6

A

1004-616X(2016)02-0121-05

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.008

2016-02-01；

2016-03-03

环境医学工程教育部重点实验室开放课题(2015EME001)；中央高校基本科研业务费专项基金和江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目(SJZZ_0034)

作者信息： 于德财，E-mail：yudecai422221@163.com。*

，浦跃朴，E-mail：Yppu@seu.edu.cn