二亚硝基哌嗪上调AGR2促进鼻咽癌细胞转移

王巍巍，唐发清，李跃进

二亚硝基哌嗪上调AGR2促进鼻咽癌细胞转移

王巍巍，唐发清，李跃进*

（珠海市人民医院/暨南大学附属珠海医院检验科，广东珠海519000）

目的： 探讨二亚硝基哌嗪(DNP)通过调控AGR2表达参与鼻咽癌转移的分子机制。方法：以具有低转移潜能的鼻咽癌细胞6-10B作为研究材科，应用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测DNP对6-10B细胞的非毒性浓度；分别采用间接免疫荧光法、Western blot和实时荧光定量PCR法检测DNP对6-10B细胞中AGR2蛋白及mRNA表达的影响；采用针对AGR2基因的特异性小干扰RNA(siRNA)沉默6-10B细胞AGR2的表达，并用Transwell小室法检测其对细胞侵袭和迁移能力的影响。结果：MTT法检测DNP对6-10B细胞的非毒性浓度为0～10.0 μmol/L；8.0 μmol/L DNP处理6-10B细胞后，间接免疫荧光法检测发现AGR2蛋白表达明显上调，且以在细胞质中表达为主；不同浓度的DNP处理6-10B细胞24 h或用8.0 μmol/L的DNP处理6-10B细胞不同时间后，Western blot结果发现AGR2蛋白的表达水平增加且呈浓度和时间依赖性(P＜0.05)；siRNA-AGR2沉默6-10B细胞屮AGR2基因的表达后，DNP诱导6-10B细胞的侵袭及迁移能力较干扰前明显降低(P＜0.05)。结论：DNP可能通过在转录水平上调AGR2的表达，影响鼻咽癌细胞的侵袭和转移能力。

鼻咽癌；二亚硝基哌嗪；AGR2；肿瘤转移

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate theinduction of AGR2 expression by dinitrosopiperazine (DNP) in nasopharyngeal cancer cell (NPC) 6-10B and to explore involvement of DNP in NPC metastasis. METHODS：Noncytotoxic concentrations of DNP on 6-10B cells were determined using MTT. Expression of AGR2 protein and mRNA in 6-10B cells which were treated with DNP were detected by indirect immunofluorescence，Western blotting and real-time RT-PCR，respectively. In addition，silencing the expression of AGR2 by siRNA-AGR2 was investigated. The capabilities of invasion and migration of 6-10B cells were investigated using Transwell assay. RESULTS：The range of non-cytotoxic concentrations (NCC) of DNP was 0-10.0 µmol/L. The results of indirect immunofluorescence showed AGR2 mainly expressed in cytoplasm after DNP treatment. These and 5-8F cells had stronger fluorescence intensity than untreated 6-10B cells. The DNP-induced AGR2 expression showed dose- and time-dependent effects. Real-time RT PCR analyses showed that AGR2 mRNA expression rate was 1.01±0.08 in the untreated 6-10B cells and 3.96±0.15 in the cells treated with 8.0 µmol/L DNP. The difference was significant. In addition，the relative fold gene expression of AGR2 in 5-8F cells was higher than that in non-treated 6-10B cells (P＜0.05). The transwell migration and invasion data showed that siRNA-AGR2 transfection blocked AGR2 expression in 6-10B cells. In addition，both DNP-induced invasion and motility were dramatically decreased when AGR2 expression was blocked (P＜0.05). However，DNP could effectively induce cell invasion (P＜0.05) and motility (P＜0.05) when AGR2 was not blocked. CONCLUSION：DNP could up-regulate AGR2 expression in 6-10B cells through transcriptional regulation mechanism and then mediate the metastasis of nasopharyngeal cancer cells.

【KEY WORDS】nasopharyngeal cancer；dinitrosopiperazine；AGR2；neoplasm metastasis

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方地域比较常见的恶性肿瘤之一[1]，其发生以南方的广东、广西、湖南等地发病率最高，具有显著的种族和地域分布的特点，是一种与遗传及环境因素密切相关的疾病[1-2]，但发病机制目前尚未完全明确。早期的流行病学调查和实验研究发现，鼻咽癌发病的风险与经常食用熏肉、咸鱼及腌制食品等饮食习惯有关[3-4]，原因是这些食物的制作方法会增加包括二亚硝基哌嗪(N，N'-Dinitrosopiperazine，DNP)在内的N亚硝胺。 研究证实DNP可诱导鼻咽癌的发生，并对鼻咽细胞具有很高的组织亲和性[5]。其不仅参与鼻咽癌的癌变过程[6]，还与鼻咽癌的转移密切相关[7]。AGR2基因在生物的发育和生长过程中发挥着重要作用[8-9]，具有多种生物学功能，在外界刺激因子的作用下高表达，促进细胞生长和细胞侵袭转移等。在本课题组前期研究中，通过蛋白组学SILAC 方法比较了DNP处理组细胞和DMSO对照组细胞中的蛋白表达差异，发现在DNP处理组细胞中AGR2显著高表达。由此推断DNP可能通过上调AGR2参与鼻咽癌转移。本研究拟以低转移性6-10B细胞为细胞模型，用DNP处理后，通过分析DNP对6-10B中AGR2的表达及侵袭和转移能力的影响，探讨DNP参与鼻咽癌转移的分子机制。

1　材料与方法

1.1主要材料

人鼻咽癌细胞株6-10B和5-8F购自中南大学湘雅中心实验室细胞库，为鼻咽癌细胞株SUNE-1的两个亚株，具有相同的遗传背景，5-8F具有高成瘤、高转移的能力，而6-10B则只成瘤、不转移。DNP由湖南省农业大学化学生物教研室合成，为一环状亚硝基化合物，分子式为C4H8N4O2。兔抗人AGR2抗体购自Abcam公司。PCR引物，特异性针对AGR2基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)及阴性对照siRNA-Mock均由上海生工生物工程有限公司合成并修饰。PCR试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。Transwell小室和化学发光显色试剂盒购自Corning公司。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。反转录酶M-MLV购自中山大学达安基因股份有限公司。定量PCR用的SYBR Green PCR Master Mix购自TOYOBO公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养鼻咽癌6-10B和5-8F分别用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，待细胞贴壁生长后，采用0.2%胰蛋白酶消化后传代培养1～2 d。

1.2.2MTT法筛选DNP处理6-10B细胞的非毒性浓度将6-10B细胞按每孔2×103个的密度接种至96孔板，37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养24 h左右，制备细胞板，供MTT实验使用。将DNP用10%胎牛血清的RPMI-1640培养基分别稀释至16.0、14.0、12.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0 µmol/L，分别加在96孔细胞板中，每种浓度设置3个复孔。37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养24 h，每孔加入20 µL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔再加入150 µL DMSO，摇床上低速振荡10 min左右，待结晶物充分溶解后，酶联免疫检测仪测量波长为492 nm处各孔的吸光度值D(492)，参考波长为630 nm。通过检测活细胞数，计算DNP处理6-10B细胞的非毒性浓度(non-cytotoxic concentration，NCC)。

1.2.3间接免疫荧光法检测AGR2蛋白的表达及定位

6-10B细胞按每孔1×104个的密度接种于6孔板中，培养24 h，加入DNP(8.0 µmol/L)处理细胞24 h，以未加DNP处理的细胞为空白对照组，未加DNP处理的5-8F为阳性对照组。收集细胞，用预冷的甲醇溶液固定细胞，PBS漂洗细胞3次，加入含5%小牛血清白蛋白的封闭液封闭处理30 min，加入一抗兔抗人AGR2单克隆抗体(1∶100稀释)，4 ℃反应过夜，用PBS漂洗3次，加入二抗(FITC-羊抗兔IgG，1∶100稀释)，室温反应1 h，再加入DAPI染色细胞核，最后在激光共聚焦显微镜(×1 000)下观察AGR2蛋白表达和亚细胞定位的情况。实验重复3次。

1.2.4Western blot检测AGR2蛋白的表达收集各组细胞，用试剂盒提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取10 µg蛋白进行SDS-PAGE分离蛋白，并转移至PVDF膜上，经一抗(AGR2兔抗人单克隆抗体，GAPDH兔抗人单克隆抗体)和二抗(HRP标记的抗兔二抗)反应，最后采用化学发光显色试剂盒发光显影。实验重复3次。

1.2.5实时荧光定量PCR检测AGR2 mRNA的表达实验分成3组：DNP(0.0 µmol/L)处理6-10B细胞组；DNP(8.0 µmol/L)处理6-10B细胞组；5-8F细胞对照组。收集各组细胞，采用Trizol试剂提取细胞总RNA，检测总RNA纯度和完整性，按说明书进行操作，取4 µL总RNA，用反转录试剂盒反转录为cDNA，反应体系如下：5×逆转录buffer 4.0 µL，dNTPs(10 mmol/L) 0.5 µL，M-MLV(200 U/µL) 1.0 µL，DEPC水 10.0 µL，RNA模板4.0 µL，总体积 20.0 µL。反应条件：37 ℃、1 h，然后95 ℃、3 min。取6 µL cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，反应条件：95 ℃、 5 min；95 ℃、15 s，65 ℃、15 s，共40个循环。反应体系：5×buffer 10.0 µL，上游引物1.0 µL，下游引物1.0 µL，探针1.0 µL，dNTPs 1.0 µL，Taq酶1.0 µL，补水至总体积50.0 µL，以18 s rRNA作为内参照，采用2-△△CT法计算基因的相对表达量。AGR2基因引物序列：上游5´-GTCAC GTGGCCCAGATTTAT-3´，下游5´-TCTCCTTCTTGGAA GCCTCA-3´。18 s rRNA引物序列：上游5´-CCTGGAT ACCGCAGCTAGGA-3´，下游5´-GCGGCGCAATACGA ATGCCCC-3´。

1.2.6siRNA-AGR2的设计及基因转染siRNAAGR2和siRNA-Mock由锐博公司合成，每个siRNA序列5 nmol，干扰片段序列如下：Mock，5´-GCTACACA AATCAGCGATTT-3´；siAGR2-1，5´-CUGAUUAGGU UAUGGUUUATT-3´；按Lipofectamine 2000说明书的方法操作，将siRNA-AGR2和siRNA-Mock分別瞬时转染至6-10B细胞，培养12 h。采用8.0 µmol/L的DNP处理转染后的细胞，24 h后，Western blot检测AGR2蛋白的表达情况，分析siRNA对AGR2基因沉默的效率。未用DNP处理组中则加入含0.01%的DMSO培养液进行培养。

1.2.7 细胞侵袭和迁移能力的检测取转染后培养至对数生长期的6-10B细胞1×104个，采用8.0 µmol/L的DNP处理细胞24 h后，将细胞加入Boyden-champer(用含基质成分的Matrigel胶包被)上室，下室中则加入含20%胎牛血清的培养液，培养12 h。用棉签除去未迁移的细胞。甲醇溶液固定细胞后，结晶紫染色。光学显微镜下计数细胞。细胞迁移能力的检测，同样将1×104个6-10B细胞接种于Boyden-champer(未用含基质成分的Matrigel胶包被)上室，培养12 h，固定并染色细胞，光学显微镜下计数细胞。实验重复3次。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。采用单因素方差分析比较-多组间均数；独立样本t检验比较两组间均数。采用x±s表示计量资料，所有检验均为双侧检验，以α=0.05作为检验水准。

2　结果

2.1DNP对6-10B细胞的非毒性浓度

MTT实验结果见图1，显示6-10B细胞在DNP 0～10.0 μmol/L浓度范围，细胞生长无明显影响(P＞0.05)，即DNP处理6-10细胞的非毒性浓度为0～10.0 μmol/L。后续实验从该范围内选择DNP的实验浓度。

2.2DNP对鼻咽癌细胞中AGR2蛋白表达的影响

AGR2使用的二抗为红色标记的山羊抗兔IgGFITC，细胞核DAPI染色呈蓝色。间接免疫荧光法检测结果见图2，可见6-10B细胞组、8.0 μmol/L DNP处理6-10B细胞组及5-8F细胞组各组细胞中均有AGR2蛋白的表达，并以在细胞质中表达为主，其中以DNP处理组6-10B细胞中蛋白表达最为显著。

图2　DNP对6-10B细胞中AGR2表达的影响

2.3DNP对6-10B细胞AGR2蛋白表达的影响

采用了非毒性浓度的DNP处理6-10B细胞，Western blot检测6.0、8.0、10.0 µmol/L DNP分别处理6-10B细胞24 h后AGR2的表达水平，以及8.0 µmol/LDNP分别处理6-10B细胞12、18、24 h后AGR2的表达水平。结果显示，未经DNP处理的6-10B细胞AGR2的表达水平很低，6.0、8.0、10.0 µmol/L不同浓度DNP处理后6-10B细胞AGR2表达水平均高于未处理组，且随DNP浓度的增大表达逐渐增多(P＜0.05)，表现出一定的浓度依赖性(图3A、3C)；随着DNP诱导时间的延长，AGR2的表达逐渐增强，药物处理24 h组AGR2的表达明显增强(P＜0.01)，呈现出一定的时间依赖性(图3B、3D)。AGR2在5-8F细胞组中的表达量明显高于未经DNP处理的6-10B细胞组。

图3　非毒性浓度的DNP处理6-10B细胞后AGR2表达的浓度和时间效应

2.4DNP对6-10B细胞中AGR2 mRNA表达的影响

实时荧光定量PCR检测结果见图4，可见8.0 µ mol/L的DNP处理6-10B细胞24 h后，AGR2 mRNA的相对表达量明显高于DNP未处理组(P＜0.05)。

图4　实时荧光PCR定量法检测DNP处理后对6-10B细胞中AGR2-mRNA表达的影响

2.5沉默AGR2基因对DNP诱导6-10B细胞转移的影响

为进一步明确DNP在诱导6-10B细胞侵袭转移中的作用，沉默AGR2的表达后，实验分成4组：Mock对照组；DNP(8.0 µmol/L)+Mock组；siRNA-AGR2组；DNP(8.0 µmol/L)+siRNA-AGR2组。培养24 h后，检测各组AGR2的表达，结果显示，DNP(8.0 µmol/L)+ siRNA-AGR2组AGR2的表达明显低于DNP(8.0 µmol/L)+ Mock组(P＜0.05，图5A、5B)。细胞侵袭和迁移检测结果显示，DNP(8.0 µmol/L)+siRNA-AGR2组的侵袭及迁移能力较Mock组均未发生明显变化，但较DNP (8.0 µmol/L)+Mock组则均明显降低(P＜0.05，图5C～F)。说明AGR2蛋内表达下调后，细胞的迁移和侵袭通力都被抑制。提示AGR2可能是DNP作用的靶蛋白之一。

3　讨论

NPC是我国南部和东南亚最常见的恶性肿瘤之一，具有较高的侵袭转移能力。虽然NPC对放疗敏感，但5年生存率仍在50%～60%，即使经过正规的治疗，还有30%左右III期、IV期的鼻咽癌患者发生远端器官转移[10]。一旦颈部淋巴结出现转移，5年生存率小于50%；而若远端器官发生转移，5年生存率则只有20%左右，最常见的远端转移部位包括骨(20%)、肺脏(13%)、肝脏(9%)[11]等。因此，挖掘鼻咽癌转移发生的分子机制，并加以行之有效的干预措施控制其转移，成为鼻咽癌研究的热点和重点。

亚硝胺类化合物是鼻咽癌致癌过程中的重要化学致癌物之一，在前期研究工作中，我们将DNP少量多次或短期大量皮下注射，成功地诱导大鼠鼻咽癌[12]。在实验中发现DNP注射量与大鼠鼻咽癌转移密切相关，DNP高剂量组大鼠鼻咽癌转移率明显增高。临床检测还发现鼻咽癌患者血清含有较健康人群高的DNP，且带颈淋巴结转移患者DNP量显著高于无转移患者。提示DNP不仅与鼻咽癌发生和发展有关，还与鼻咽癌的转移有相关性[13]。

本课题在对DNP处理6-10B细胞前后蛋白质组差异的研究发现，AGR2蛋白的表达上调[14]。AGR2被发现以来，大量证据表明AGR2在多种人类肿瘤中过量表达，并且与肿瘤的发生和转移密切相关[15-19]。因此，AGR2可能是DNP诱导鼻咽癌发生且参与转移的重要靶分子。然而，国内外提及AGR2与鼻咽癌转移相关的研究未见报道。

图5　沉默AGR2基因对DNP诱导6-10B细胞侵袭及迁移能力的影响

为探讨化学致癌物DNP促进鼻咽癌转移的分子机制，本研究中采用非毒性浓度的DNP处理低表达AGR2的6-10B细胞，发现DNP能明显诱导AGR2蛋白表达的上调，并主要表达在细胞质中，浓度为8.0 µmol/L时，其表达量甚至高于其在髙转移潜能鼻咽癌5-8F细胞中的表达水平，因此提示DNP可有效诱导AGR2蛋白的表达，AGR2蛋白的表达可能与鼻咽癌细胞的恶性程度有关。为进一步探讨DNP上调AGR2表达的分子作用机制，我们分析AGR2 mRNA的表达水平，结果表明DNP能诱导AGR2 mRNA表达的上调，提示DNP可能是通过转录水平上调蛋白的表达。因此，为进一步明确AGR2在DNP诱导6-10B细胞中的作用，本研究沉默AGR2的达后，发现DNP诱导细胞侵袭和迁移的能力显著降低，提示DNP诱导鼻咽癌细胞转移在一定程度上是通过AGR2介导的。

综上所述，本研究通过分析非毒性浓度的DNP对6-10B细胞中AGR2蛋白水平的影响以及其在诱导6-10B细胞转移中的作用，推测AGR2蛋白在鼻咽癌转移中起重要作用，为阐明鼻咽癌高转移的发病机制提供了一个新的实验证据和理论基础。

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Dinitrosopiperazine-mediated up-regulation of AGR2 expression promotes metastasis of nasopharyngeal cancer cells

WANG Weiwei，TANG Faqing，LI Yuejin*
(Department of Clinical Laboratory, Zhuhai People’s Hospital & Zhuhai Hospital of Jinan University, Zhuhai 519000, Guangdong, China)

R73-37

A

1004-616X(2016)02-0115-06

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.007

2015-11-20；

2016-01-20

国家自然科学基金资助项目(81402265)

作者信息： 王巍巍，E-mail：wangweiweicat@163.com。*

，李跃进，E-mail：liyuejincat@163.com